貴州省PCV2流行株的分型及遺傳變異分析

吳好葉 ， 徐 國(guó) ， 梁海英 ， 曾智勇 ， 湯德元 ， 王 彬 ，黃 濤 ， 張愛(ài)瓊 ， 何小莉 ， 咸 文 ， 陳 娟

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州貴陽(yáng)550025 ； 2.貴州省興義市農(nóng)村工作委員會(huì)貴州興義562400)

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無(wú)囊膜，直徑約17 nm，呈二十面體對(duì)稱，基因組為單股閉合環(huán)狀DNA，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一。PCV2的基因組被認(rèn)為劃分為11個(gè)開放閱讀框(Open reading frames,ORFs)，ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒基因組正鏈上，ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11位于病毒基因組負(fù)鏈上，11個(gè)閱讀框有部分互相重疊，使PCV2有限的基因組得到充分利用[1]。歐盟豬圓環(huán)病毒疾病委員組織于2008年討論了PCV2基因分型[2]：PCV2可分為3個(gè)基因亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c。2009年，楊漢春等[3]對(duì)我國(guó)PCV2原有分型進(jìn)行了補(bǔ)充：存在PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e 基因型。2003年之前，PCV2a和PCV2b在歐洲和美國(guó)流行，PCV2a僅在北美洲流行[4]；2003年后，隨著發(fā)病豬狀況日益嚴(yán)重，國(guó)外PCV2的主要流行基因型也由PCV2a逐漸轉(zhuǎn)變成PCV2b[5-6]；在國(guó)內(nèi)許多省市也展開PCV2流行株的分型調(diào)查，結(jié)果顯示，PCV2b基因型為大部分地區(qū)所流行的基因型。崔亞蘭等[7]對(duì)貴州省2007-2011 年收集4 980份各地區(qū)豬血清進(jìn)行PCV2抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為43.45%，且呈上升趨勢(shì)，對(duì)PCV2病原核酸檢測(cè)，陽(yáng)性率高達(dá)77.44%，表明PCV2在貴州省廣泛存在。綜上，PCV2的感染情況變得愈加復(fù)雜多變，在全球PCV2b基因型開始逐漸取代PCV2a基因型[18]。

本研究旨在了解貴州地區(qū)PCV2的分子流行病學(xué)狀況及遺傳差異，將2012-2016年間所獲得的16株貴州分離株P(guān)CV2基因序列與NCBI上已公布的35株參考序列進(jìn)行分析研究，以期為PCV2的分子流行病學(xué)及遺傳變異研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源 本研究中所分析的16株P(guān)CV2全基因序列為本課題組2012-2016年間參照文獻(xiàn)[9]克隆測(cè)序所獲得的，序列相關(guān)信息見(jiàn)表1。35株參考序列為在NCBI上國(guó)內(nèi)外各省市檢測(cè)公布的。

1.2 PCV2基因型分析 通過(guò)MEGA6.0軟件構(gòu)建PCV2核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹，并參考2008年歐盟豬圓環(huán)病毒疾病委員會(huì)提出的PCV2基因分型的標(biāo)準(zhǔn)[2]，規(guī)定在PCV2全基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹上毒株間的遺傳距離>0.02，或在以PCV2 ORF2序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹上兩毒株間遺傳距離>0.035時(shí)可將其劃為不同基因型，各基因型指定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)參考毒株(PCV2a AF055392、PCV2b AF055394、PCV2c EU148503、PCV2d EF524517)，對(duì)51株P(guān)CV2毒株進(jìn)行分型。

表1 貴州PCV2分離株基本信息

2 結(jié)果

2.1 PCV2全基因的克隆 提取病毒液核酸以其為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得PCV2全基因組，純化回收后連至pMD19-T 載體上。抽提克隆質(zhì)粒，分別進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定和HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定。將經(jīng)鑒定均為陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)序列的GenBank Blast結(jié)果表明，序列均為PCV2全基因組序列。

2.2 PCV2基因型分析 通過(guò)MEGA 6.0軟件，以51株P(guān)CV2全基因組序列為分析對(duì)象構(gòu)建了PCV2核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示，本次所分析的16株P(guān)CV2序列中3株為PCV2a型，5株為PCV2b型，8株為PCV2d型；表明貴州地區(qū)的PCV2流行病毒株有逐步趨向PCV2d的流行趨勢(shì)。

2.3 PCV2基因組序列分析 通過(guò)DNAStar軟件的EditSeq模塊對(duì)貴州地區(qū)PCV2分離株的全基因序列和ORF2序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，貴州省PCV2流行株之間的全基因和ORF2序列大小有一定的差異，PCV2a的全基因組大小為1 768 nt，比PCV2b和PCV2d的全基因組多1個(gè)堿基，通過(guò)多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其多出的堿基T位于PCV2a基因組正鏈的第1 044位，相應(yīng)多出的氨基酸G位于第494位氨基酸。其次，PCV2a、PCV2b、PCV2d ORF2基因組大小分別為702 nt、702 nt、705 nt。在PCV2a、PCV2b、PCV2d這3種基因型中，同種基因型之間的PCV2全基因和ORF2所編碼的氨基酸序列相似性都較高，說(shuō)明PCV2的序列保守性可能與基因型相關(guān)。通過(guò)DNAStar軟件的MegAlign模塊分析51株P(guān)CV2毒株之間的核苷酸序列的差異，結(jié)果顯示，各PCV2毒株的核苷酸序列之間的變異率各不相同，其中變異率較大的為ORF6(32.22%)、ORF10(29.63%)、ORF2(24.11%)、ORF5(21.60%)、ORF7(20.00%)，具體見(jiàn)下表(見(jiàn)表2)。

圖1 PCV2核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

表2 PCV2各ORFs基因序列變異情況分析

整體上，在對(duì)16株P(guān)CV2 ORF2的氨基酸序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)氨基酸差異一共有48處，其中因基因型不同而引起的差異有31處，進(jìn)一步表明了PCV2同種基因型之間較為保守。在這些差異中PCV2a與PCV2b有8處相同，PCV2a與PCV2d有4處相同，PCV2b與PCV2d有17處相同(表3)。表明不同基因型的PCV2之間的氨基酸序列相似性不高，不同基因型之間包括抗原性在內(nèi)的其他特性可能會(huì)有所差異。另外，對(duì)PCV2 ORF2氨基酸序列進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)，PCV2a之間的氨基酸序列相似性為98%～100%，PCV2b之間的氨基酸序列相似性為98.3%～99.3%，PCV2d之間的氨基酸序列相似性為98.6%～99.9%。PCV2a與PCV2b之間的氨基酸序列相似性為91.3%～92.6%，PCV2a與PCV2d之間的氨基酸序列相似性為89.2%～90.0%，PCV2b與PCV2d之間的氨基酸序列相似性為93%～94.6%。由此可見(jiàn)，編碼PCV2的衣殼蛋白的ORF2在同種基因型之間也具有較高的保守性，而在不同基因型之間的差異性則相對(duì)較大，其中PCV2a與PCV2d的衣殼蛋白的氨基酸相似性最高僅為90%。由此推測(cè)不同基因型之間ORF2的抗原性可能存在較大的差異。PCV2b與PCV2d的衣殼蛋白氨基酸相似性明顯高于PCV2a與PCV2d的相似性，同時(shí)也證實(shí)PCV2b與PCV2d具有較近的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

3 討論

PCV2引起豬的皮炎腎病綜合征、肉芽腫性腸炎、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征和母豬繁殖障礙等系列綜合癥候稱圓環(huán)病毒病(PCVD)。自2000年郎洪武在我國(guó)報(bào)道有PCV2以來(lái)，我國(guó)豬群PCVD頻發(fā)，且死亡率不斷增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本文采用多種生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)絡(luò)公共資源對(duì)本實(shí)驗(yàn)室所分離的PCV2毒株基因組進(jìn)行了比較、分析和預(yù)測(cè)。本次所分析的16株P(guān)CV2序列中3株為PCV2a型，5株為PCV2b型，8株為PCV2d型，該結(jié)果表明，PCV2d已經(jīng)逐漸成為貴州地區(qū)的PCV2主要流行毒株，這些毒株基因復(fù)雜多變，且與近年來(lái)PCV2d型逐漸上升的報(bào)道相吻合[10-11]。PCV2b與PCV2a和PCV2d之間的差異遠(yuǎn)小于PCV2a與PCV2d的差異，并與PCV2a和PCV2d都具有較高的相似性，結(jié)合3種基因型的流行時(shí)段分析，推測(cè)PCV2b可能是PCV2a向PCV2d演變的一個(gè)過(guò)渡基因型。

表3 貴州地區(qū)PCV2各基因型ORF2的氨基酸差異

文中貴州PCV2a、PCV2b、PCV2d基因型之間的全基因序列和ORF2序列大小有一定的區(qū)別，且各PCV2毒株的核苷酸序列之間的主要差異存在于ORF2和ORF1內(nèi)。由于ORF2編碼PCV2的結(jié)構(gòu)蛋白，決定其抗原性，同時(shí)與病毒的致病性有關(guān)[1]，ORF6和ORF7參與病毒的復(fù)制，ORF5與病毒的致病力有關(guān)，其缺失可致病毒致病力減弱[12-13]，由此可以推測(cè)，在不同的PCV2分離株之間，PCV2的抗原性、致病力、復(fù)制能力可能都會(huì)有一定的差異，文中有因堿基突變或缺失導(dǎo)致編碼框不編碼蛋白的毒株，如第1 206位堿基突變由→A，導(dǎo)致ORF4不編碼氨基酸的GZ-KY株,缺失ORF11的GZ-MT株、GZ-XW1株可作為基因疫苗的候選毒株進(jìn)行后續(xù)研究。

本文所涉及毒株均來(lái)源于田間樣本，這些樣本大部分存在豬瘟病毒、繁殖與呼吸綜合征病毒和胸膜肺炎放線桿菌等病原體混合感染，且患病豬表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，證實(shí)了當(dāng)前豬場(chǎng)疾病感染己不再單一。本試驗(yàn)未用同一病毒液提取核酸來(lái)對(duì)PCV2基因組多次克隆分析，從而未能驗(yàn)證同一樣本中是否存在PCV2多種基因型混合感染的情況，后續(xù)將就此繼續(xù)展開研究。