中藥牛大力對(duì)尿酸鹽誘導(dǎo)小鼠模型滑膜細(xì)胞炎癥的影響

黃慧　陳洪　黃桂瓊　袁維蔚

[摘要]目的 探討中藥牛大力對(duì)尿酸鹽誘導(dǎo)小鼠模型滑膜細(xì)胞炎癥的影響。方法 SPF級(jí)雄性Wistar小鼠60只隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組和研究組[牛大力低（4.55 g/kg）、中（9.10 g/kg）、高（13.65 g/kg）劑量組]，每組各10只。除正常對(duì)照組外連續(xù)給藥7 d，正常對(duì)照組及模型組不做任何給藥，每日灌胃等量的生理鹽水，其余四組均通過小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)注射尿酸鹽制造急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，檢測比較造模前和注射尿酸鹽48 h的血清一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）等炎癥因子水平和血清尿酸（UA）水平。模型組驗(yàn)?zāi)こ晒竺擃i處死并取關(guān)節(jié)囊和滑膜組織行HE染色觀察小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變情況，牛大力各劑量組以牛大力低、中、高劑量煎制成湯藥，每天上午9點(diǎn)灌胃治療1次，均連續(xù)治療7 d。治療3、7 d時(shí)再次檢測比較牛大力低、中、高劑量組的血清炎癥因子水平和血清UA水平，并在治療7 d后兩組滑膜組織行HE染色觀察小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變情況。結(jié)果 四組注射尿酸鹽48 h的血清NO水平較建模前降低，而血清IL-1β、TNF-α、PGE2等炎癥因子水平和血清UA水平均高于建模前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HE染色觀察顯示，牛大力中、高兩劑量組滑膜組織血管充血腫脹，炎性細(xì)胞浸潤明顯。牛大力低、中、高劑量組治療3、7 d的血清NO水平均明顯高于模型組，而血清炎癥因子水平和血清UA水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；牛大力低、中、高劑量組治療3、7 d的血清NO水平均明顯高于治療前，而血清炎癥因子水平和血清UA水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療7 d后HE染色觀察顯示，牛大力低、中、高劑量滑膜組織炎癥浸潤改善，病癥緩解，但模型組小鼠滑膜組織炎癥無明顯改善。結(jié)論 中藥牛大力有助于緩解尿酸鹽誘導(dǎo)小鼠模型滑膜細(xì)胞炎癥，值得推廣。

[關(guān)鍵詞]牛大力；尿酸鹽；小鼠；滑膜細(xì)胞；炎癥

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）7（b）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the influence of Chinese herbal medicine Millettia speciosa champ on the synovial cells inflammation of mouse model induced by urate. Methods A total of 60 male Wistar mice of grade SPF were randomly divided into the normal control group， the model group， and the study group （low doses group of 4.55 g/kg， middle does group of 9.10 g/kg， and high doses group of 13.65 g/kg）， 10 cases in each group. Except for the normal control group， the drug was continuously given to 7 d， while the normal control group and the model group did not take any medicine， and given the same amount of normal saline daily to the stomach， the other four groups were injected urate into the right ankle joint to create an acute gouty arthritis model. The levels of serum nitric oxide （NO）， interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor （TNF-α）， prostaglandin E2 （PGE2）， and serum uric acid （UA） were measured and compared between before model establishment and after injection of urate 48 h. After successful examination， the model group was sacrificed and the joint capsule and synovial tissue were selected. HE staining was used to observe the pathological changes of the synovial tissue of the right ankle joint in mice. Each dose group was decocted with low， medium and high doses of Millettia speciosa champ， each group was treated with gavage for 1 times at 9 am， for 7 consecutive days. In the treatment of 3 and 7 d， the levels of serum inflammatory factors and serum UA levels in the low， medium and high doses groups of Millettia speciosa champ were measured again， and after 7 d treatment， the synovial tissues of two groups were stained with HE to observe the pathological changes of synovial tissue in the right ankle. Results The level of serum NO in four groups after injection of urate 48 h was lower than that before modeling， while the serum levels of IL-1β， TNF-α， PGE2 and serum UA were higher than those before the modeling， with significant difference （P<0.05）. HE staining showed that there was congestion and swelling in the blood vessels of synovial tissue in the medium and high doses groups of Millettia speciosa champ， and the infiltration of inflammatory cells was obvious. The serum NO levels in the low， medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were significantly higher than those in the model group， and the level of serum inflammatory factors and serum UA in the low， medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were lower than that in the model group， with significant difference （P<0.05）. The serum NO levels in the low， medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were significantly higher than those before treatment， and the level of serum inflammatory factors and serum UA in the low， medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were lower than that before treatment， with significant difference （P<0.05）. After treatment for 7 d， HE staining showed that the inflammatory infiltration of the synovial tissue in the low， middle and high doses group of Millettia speciosa champ was improved and the disease was relieved， but there was no obvious improvement in the synovial tissue inflammation in the model group. Conclusion Chinese herbal medicine Millettia speciosa champ can help alleviate the inflammation of the mouse model synoviocytes induced by urate， which is worthy of popularizing.

[Key words] Millettia speciosa champ； Urate； Mice； Synovial cells； Inflammation

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由嘌呤代謝障礙和血尿酸（UA）增高所引發(fā)的組織損傷，臨床發(fā)病率較高[1-2]，因此，對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行及時(shí)有效的治療十分重要。然而目前尚無有效的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療藥物和方法，對(duì)其有效治療藥物的開發(fā)具有重要的臨床意義[3-4]。近年來，中醫(yī)藥在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用得到了多個(gè)研究的認(rèn)可，其中牛大力在其中的應(yīng)用較多[5-7]。本研究亦關(guān)注了中藥牛大力應(yīng)用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎對(duì)小鼠滑膜細(xì)胞炎癥的影響，從而為其在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用推廣提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取SPF級(jí)雄性Wistar小鼠60只，均為雄性小鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，單獨(dú)飼養(yǎng)自由進(jìn)食和飲水。將所有小鼠編號(hào)并按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（n=10）、模型組（n=10）、牛大力低劑量組（n=10）、牛大力中劑量組（n=10）、牛大力高劑量組（n=10）。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)。各組小鼠的基本資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1），具有可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1牛大力高、中、低模型組劑量確定 參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》附錄；若人的臨床劑量為A mg/kg，則小鼠的劑量=A mg/kg×70 kg×0.0026/20 g=A mg/kg×70 kg×0.0026/0.02 kg=9.1 A mg/kg。

牛大力單方臨床使用量為0.5～1.5 g/kg，通過公式換算得到小鼠劑量范圍為4.55～13.65 g/kg。即牛大力高劑量組給藥量為13.65 g/kg，牛大力中劑量組給藥量為9.10 g/kg，牛大力低劑量組給藥量為4.55 g/kg。

1.2.2建模 將除正常對(duì)照組外的其余四組小鼠均在右側(cè)踝關(guān)節(jié)注射100 μl的3%尿酸鈉溶液，關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起確認(rèn)注入成功，制造急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測 分別在造模前1 d和注射尿酸鹽48 h檢測血清一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）等炎癥因子水平和血清UA水平，檢測當(dāng)天在眼眶后靜脈叢取血，將獲得的樣本均常規(guī)進(jìn)行離心和冷藏待測處理，其中血清UA水平和血清NO水平的檢測采用全自動(dòng)生化分析儀，血清IL-1β、TNF-α、PGE2等炎癥因子水平的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，相關(guān)試劑盒均購自上?？道噬锟萍加邢薰荆唧w檢測操作嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。

1.2.4組織病理檢測 模型組驗(yàn)?zāi)こ晒竺擃i處死并取關(guān)節(jié)囊和滑膜組織，將獲取的組織固定后常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋和切片，并常規(guī)行HE染色，光鏡下觀察小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變情況。

1.2.5治療方法 正常組及模型組每天早上9點(diǎn)灌胃15 ml生理鹽水。牛大力各劑量組以牛大力低（4.55 g/kg）、中（9.10 g/kg）、高（13.65 g/kg）備用藥液每天上午9點(diǎn)灌胃治療1次，每次10 ml，均連續(xù)治療7 d。

1.2.6治療后指標(biāo)檢測 治療3、7 d時(shí)再次檢測比較牛大力各劑量組血清炎癥因子水平和血清UA水平，具體取樣和檢測方法同“1.2.3”。并在治療7 d后兩組滑膜組織行HE染色觀察小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變情況，具體取樣和檢測方法同“1.2.4”。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用校正χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組計(jì)量資料比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)，兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組治療前后血清炎癥因子水平和血清UA水平的比較

治療前，各組血清炎癥因子水平和血清UA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。四組注射尿酸鹽48 h的血清NO水平明顯低于建模前，而血清IL-1β、TNF-α、PGE2等炎癥因子水平和血清UA水平均高于建模前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；牛大力低、中、高劑量組治療3、7 d的血清NO水平明顯高于模型組，而血清炎癥因子水平和血清UA水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；牛大力低、中、高劑量組治療3、7 d的血清NO水平明顯高于治療前，而血清炎癥因子水平和血清UA水平明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.2尿酸鹽誘導(dǎo)小鼠模型滑膜細(xì)胞炎癥HE染色觀察

HE染色觀察顯示，模型組滑膜組織血管充血腫脹，炎性細(xì)胞浸潤明顯（圖1-B）。

2.3牛大力低、中、高三劑量組小鼠滑膜組織炎癥變化分析

治療7 d后HE染色觀察顯示，牛大力中、高劑量組滑膜組織炎癥浸潤改善，病癥緩解，但牛大力低劑量組小鼠滑膜組織炎癥無明顯改善（圖1-C、圖1-D、圖1-E）。

3討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為高尿酸所引發(fā)的相關(guān)關(guān)節(jié)病癥，近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，其臨床發(fā)病率不斷升高[8-9]。關(guān)節(jié)炎癥可給患者帶來明顯的疼痛感甚至影響其正常生活活動(dòng)，降低患者生活質(zhì)量[10-13]。本研究通過小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)注射尿酸鹽制造急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，所有研究小鼠均驗(yàn)?zāi)Ｍㄟ^，可進(jìn)行相關(guān)研究。本研究中的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型血清學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示血清NO水平降低，而血清IL-1β、TNF-α、PGE2等炎癥因子水平以及血清UA水平升高。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠持續(xù)高血清UA水平炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，HE染色觀察結(jié)果顯示，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織血管充血腫脹，炎性細(xì)胞浸潤明顯，而外觀可見其右側(cè)踝關(guān)節(jié)明顯腫大，部分可影響活動(dòng)。改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)性對(duì)改善其療效具有重要意義[14]。

近年來，中醫(yī)藥技術(shù)在臨床中的應(yīng)用不斷推廣，其在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用也得到了認(rèn)可[15-17]。在抗炎治療中，牛大力的應(yīng)用較多，牛大力可提高免疫功能、抗炎抗氧化，在臨床中應(yīng)用較為廣泛[18-19]。本研究將牛大力應(yīng)用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型治療中，結(jié)果顯示，中藥牛大力治療有助于血清NO水平升高，而血清炎癥因子水平和血清UA水平降低；免疫病理檢查顯示其可改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠的滑膜組織炎癥浸潤，緩解病癥，進(jìn)一步證實(shí)了牛大力在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用效果，其機(jī)制可能是本研究治療藥方中的牛大力補(bǔ)虛潤肺、強(qiáng)筋活絡(luò)，輔以千斤拔祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨、消炎止痛功效以及土茯苓的泄?jié)峤舛?、健胃利濕、通利關(guān)節(jié)功效可有效抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織炎癥，改善病情，促進(jìn)病癥好轉(zhuǎn)，這與赫軍等[20]的研究中牛大力可有效改善炎癥反應(yīng)的結(jié)論一致。此外，本研究治療中小鼠無明顯的不良反應(yīng)，牛大力在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療中的可行性和安全性均良好，值得臨床推廣。

綜上所述，中藥牛大力應(yīng)用于尿酸鹽誘導(dǎo)小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型中可有效緩解其滑膜細(xì)胞炎癥，是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療的有效中藥之一。

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（收稿日期：2018-05-03 本文編輯：祁海文）