單穎，劉子琦，施杏芬，李國煒，陳聰，羅浩，劉亞杰，方維煥，李肖梁*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；2.浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，杭州310020）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉、脫水等為主要特征，多發(fā)于秋冬季節(jié)，主要感染哺乳仔豬，其中7日齡以下的哺乳仔豬死亡率最高[1]。1978年，英國、比利時(shí)首次發(fā)現(xiàn)該病[2]。近年來，PEDV在包括中國、韓國、日本等國家在內(nèi)的亞洲地區(qū)廣泛流行[3-5]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。PEDV在浙江省的臨床檢出率由2010年的42.86%提高到了2013年的70%以上[6]。

PEDV是套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）的成員，為有囊膜的、不分節(jié)段的、單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約28 kb，包括5′端非編碼區(qū)、3′端非編碼區(qū)及至少7個(gè)開放閱讀框（open reading frame,ORF）[7-8]。其中5個(gè)開放閱讀框編碼主要的結(jié)構(gòu)蛋白，包括纖突（spike,S）蛋白、ORF3、小膜（envelope,E）蛋白、膜（membrane,M）蛋白、核衣殼（nucleocapsid,N）蛋白[9]。PEDV的S蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，屬于Ⅰ型膜蛋白，含有主要的抗原決定簇，約由1 383個(gè)氨基酸組成，與其他冠狀病毒屬成員的S蛋白結(jié)構(gòu)相似，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：較長的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及較短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)其他冠狀病毒S蛋白保守的基序，可以將PEDV的S蛋白分為S1區(qū)（第1～789位氨基酸）和S2區(qū)（第790～1 383位氨基酸）[10]。研究表明，PEDV的S蛋白對(duì)被感染宿主中和抗體的產(chǎn)生、特異性受體的結(jié)合及細(xì)胞膜融合方面具有重要的生物學(xué)意義，S1可識(shí)別受體，S2負(fù)責(zé)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合[11]。S蛋白中的4個(gè)中和表位區(qū)（499～638、748～755、764～771和1 368～1 374）均已被鑒別[12-14]。由于受到宿主免疫選擇的壓力，S蛋白易發(fā)生變異，因此，S蛋白對(duì)于了解PEDV的流行現(xiàn)狀、分子多樣性、基因突變的聯(lián)系及疫苗的研發(fā)也有很重要的作用。

為了解現(xiàn)階段PEDV流行毒株的分子演化特征，本研究采集了2013年4月到2017年4月間浙江省及周邊地區(qū)仔豬腹瀉樣品，對(duì)引起腹瀉的主要病原進(jìn)行了檢測(cè)分析，同時(shí)對(duì)其中16株臨床分離PEDV毒株的S基因進(jìn)行了克隆和分子特征分析。研究結(jié)果豐富了PEDV分子流行病學(xué)資料，同時(shí)為疫病準(zhǔn)確診斷和有效防控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集和處理

采集浙江省及周邊24個(gè)地區(qū)共282份病料，對(duì)其進(jìn)行PEDV等病原的檢測(cè)。在小腸組織及糞便樣品中加入適量滅菌的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）并研磨，置于－80℃冰箱中反復(fù)凍融2次，4℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，保存于－80℃冰箱中，備用。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；MMLV購自美國Promega公司；pMD18-T載體、RNA酶抑制劑（HPRI）、dNTP、隨機(jī)引物、限制性內(nèi)切酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)志物（DL2000、DL5000）等均購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖購自美國Sigma公司；膠回收試劑盒購自杭州新景生物試劑開發(fā)公司。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中公布的PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、豬δ冠狀病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）和輪狀病毒A型（porcine group A rotavirus,GARV）全基因序列，利用Geneious 7.1.7軟件設(shè)計(jì)病原檢測(cè)和S基因克隆所用引物（表1），其中用3個(gè)重疊套式PCR擴(kuò)增S基因全長。引物均由上海華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 病毒RNA的抽提和反轉(zhuǎn)錄

?。?0℃保存?zhèn)溆玫牟×仙锨逡?，按總RNA提取試劑盒的操作說明書提取病毒總RNA，核酸經(jīng)NanoDrop 1000分光光度計(jì)檢測(cè)，質(zhì)量濃度為1 800～2 500 ng/μL，D（260 nm）∶D（280 nm）=1.95～2.05，保存于－80℃冰箱中。

反轉(zhuǎn)錄步驟簡述如下：1 μg總RNA與1 μL隨機(jī)引物混勻，用去核酸酶水定容至10 μL，混勻后適當(dāng)離心，65℃溫浴5 min后，立即放入冰水中冰浴5 min，適當(dāng)離心后，加入8 μL 5×RT緩沖液、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.5 μL RNA 酶抑制劑、0.5 μL MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，用去核酸酶水定容至40 μL，充分混勻后，在42℃條件下作用1 h，95℃滅活10 min，獲得的cDNA保存于－20℃冰箱中，備用。

1.5 檢測(cè)病原的反應(yīng)體系和條件

對(duì)PEDV、PDCoV和TGEV均采用一步法TaqMan探針檢測(cè)，按 LightCycler?multiplex RNA virus master試劑盒（購自上海羅氏有限公司）說明書進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為：RT-PCR反應(yīng)混合物4.0 μL，PEDV-RTF/RTR或TGEV-F/T或PDCoV-RTF/RTR 各 0.4 μ L，PEDV-RTP 或 TGEV-Probe或PDCoV-RTP 0.1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液0.1 μL，RNA模板5.0 μL，ddH2O 5.0 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄10 min；95 ℃變性30 s；95 ℃擴(kuò)增5 s，60 ℃擴(kuò)增40 s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增循環(huán)閾值（CT）小于30為陽性，30～35為可疑，大于35為陰性。

對(duì)GARV進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系簡述如下：2×Easy Taq mix酶10.0 μL，GARV-VP6-F1/R1各1.0 μL，cDNA1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃變性5min；95℃擴(kuò)增30s，55℃擴(kuò)增30s，72℃擴(kuò)增40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，預(yù)期片段大小為309bp。

表1 病原檢測(cè)和序列克隆所用引物Table 1 Primers for pathogens detecting and sequences cloning

1.6 PEDV的S基因PCR擴(kuò)增

第1輪PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板2.0 μL，10×緩 沖 液 5.0 μL，10 μmol/L PEDV-gp1-F1/R1 或PEDV-S-F3/R3或PEDV-S-F5/R5上下游引物各1.0 μL（表1），10 mmol/L dNTP 2.0 μL，PrimerSTAR DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 39.5 μL。第2輪PCR擴(kuò)增體系：模板（第1輪PCR產(chǎn)物）2.0 μL，10 μmol/L PEDV-gp1-F2/R2或PEDV-S-F4/R4或PEDV-SF6/R6上下游引物（表1）各1.0 μL，其他試劑與劑量同第1輪PCR反應(yīng)。

2輪反應(yīng)條件均為：98℃變性2 min；98℃擴(kuò)增10 s，58 ℃擴(kuò)增50 s，72 ℃擴(kuò)增3 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.7 PEDV的S基因克隆、測(cè)序和拼接

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收獲得目的片段，將純化產(chǎn)物直接送至上海華大基因科技股份有限公司測(cè)序。采用DNAStar軟件中的SeqMan進(jìn)行序列拼接。

1.8 序列分析

采用DNAStar軟件中的MegAlign及DNAman軟件對(duì)獲得的16份PEDV陽性樣品和我國其他地區(qū)的分離株、國外分離株及PEDV疫苗株CV777等（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2017.06.231）的S基因進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列同源性分析；采用MEGA 5.0中的鄰接法（neighbor-joining,NJ）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[15]。使用SignalP 4.0軟件對(duì)PEDV的S蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)[16]。使用在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析，采用DNAStar軟件中的Protean分析抗原指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙江省及周邊地區(qū)生豬腹瀉物中主要病原檢測(cè)

對(duì)浙江省及周邊24個(gè)地區(qū)的282份病料進(jìn)行PEDV、GARV、TGEV及PDCoV等病原的檢測(cè)，結(jié)果（表2）顯示：PEDV、GARV及PDCoV的檢出率分別為64.89%（183/282）、0.35%（1/282）和4.25%（12/282），而未檢出TGEV；PEDV在11月1日至次年4月1日的檢出率為74%，其余時(shí)間段的檢出率為26%（數(shù)據(jù)未列出）。

表2 浙江省及周邊地區(qū)生豬腹瀉物中主要病原檢測(cè)Table 2 Investigation on main pathogens of pig diarrhea in Zhejiang Province and surrounding areas

2.2 PEDV的S基因克隆和序列分析

選取其中16份PEDV陽性樣品（包括2013年的4份、2014年的4份、2015年的3份、2016年的3份和2017年的2份），進(jìn)行S基因克隆和測(cè)序。除ZJ13SX1101和YN170101樣本擴(kuò)增獲得的S基因全長為4 158 bp，編碼1 386個(gè)氨基酸外，其他14株S基因的全長均為4 161 bp，編碼1 387個(gè)氨基酸（圖1）。與經(jīng)典毒株CV777（JN599150.1）S蛋白相比，16份PEDV陽性樣品的S蛋白存在突變，分別為27QSTI30→SANT、56MN57→GE、62S→N、64S→T、68GGIETD74→AGQHPT、84Y→H、86DS87→RG、89Q→H、120I→T、131N→I、120I→T、150S→F、159D→S、161KNI163→EHS、178A→S、178A→S、185I→F、196R→K、210T→E、227Y→S、229E→Q、237S→I、246DS247→EP、287W→L、328F→S、367VTE369→GAT、382K→N、442V→I、637Q→E、728N→S、768L→S、778M→T、810V→A、977H→Y、1048S→A、1055I→V、1171D→A、1177GD1178→DE、1204L→F、1302R→Q、1363G→C；插入58KQGV61、140N（除ZJ13SX1101外）；缺失160G；這些突變、插入或缺失主要集中在S1蛋白片段（21～790 aa）。在PEDV疫苗株CV777的S蛋白已鑒別的4個(gè)中和表位（COE：499～638；SS2：748-755；SS6：764～771和2C10：1 368～1 374）中，所獲陽性樣品在其中有2個(gè)中和表位（SS2：748～755和2C10:1 368～1 374）與疫苗株序列完全一致。具體見附圖1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2017.06.231。

圖1 16份PEDV臨床陽性樣品的部分S基因同源性比對(duì)結(jié)果Fig.1 Homology comparison result of partial S gene sequences from 16 clinical PEDV positive samples

2.3 PEDV的S蛋白分子演化分析

與疫苗毒株CV777、SM98和DR13相比，16份陽性樣品的核苷酸同源性為93.6%～95.2%，氨基酸的同源性為92.4%～94.9%（表3）。以PEDV的S蛋白進(jìn)行分子演化分析表明：PEDV可分成3個(gè)群，疫苗株（包括CV777、SM98和DR13）均位于Ⅱa亞群，2012年后的大部分PEDV臨床分離株均位于Ⅲ群，但其中分別有1株2014年韓國分離株（KM403158.1）、1株2014年越南分離株（KP455320）和1株2015年比利時(shí)分離株（KR003452）位于Ⅱb亞群；分離株也不存在地理分布的差異性（圖2）。

2.4 PEDV的S蛋白糖基化位點(diǎn)分析

16份PEDV陽性樣品、CV777（JN599150.1，1994，中國）和CV777（AF353511.1，2001，瑞士）的S基因潛在的“Asn-X-Ser/Thr”（X為除Pro外的任何氨基酸）和Asn的N-連接糖基化位點(diǎn)分析如圖3所示。結(jié)果表明：在這18個(gè)序列中，糖基化位點(diǎn)的數(shù)量分別為28個(gè)或29個(gè)，其中，ZJ13LY1201、ZJ13XS0401、ZJ14NB0301、ZJ14YY1201、ZJ14SY1201、ZJ15JH0101、ZJ15XS0101、ZJ16XS1201、ZJ16ZJ1201的陽性樣品及疫苗株CV777（JN599150.1，1994，中國）含有28個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，但是流行株與疫苗株潛在糖基化位點(diǎn)的位置存在一定的差異；其余陽性樣品及疫苗株CV777（AF353511.1，2001，瑞士）均存在29個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，且存在的潛在N-糖基化位點(diǎn)都一樣。16份陽性樣品與疫苗株CV777（JN599150.1，1994，中國）相比，形成了3個(gè)新的N-糖基化位點(diǎn)，分別為第58位的S→N、第116位的I→T、第1193位的T→N；另外，第232位的S→I氨基酸突變則破壞了1個(gè)疫苗株原有的N-糖基化位點(diǎn)。

3 討論

本研究收集了浙江省及周邊24個(gè)地區(qū)共282份病料，并對(duì)其進(jìn)行了PEDV、GARV、PDCoV和TGEV等病原的檢測(cè)，其中PEDV的檢出率達(dá)到64.89%（183/282），感染率較高，但大部分豬場(chǎng)都使用了TGEV-PEDV二聯(lián)疫苗（基于CV777），說明疫苗不能為現(xiàn)有的流行毒株提供有效的免疫保護(hù)。因此，對(duì)PEDV流行毒株的主要抗原基因的分子流行動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在預(yù)防和控制豬流行性腹瀉中具有重要的意義。

與豬傳染性胃腸炎流行的特征類似，豬流行性腹瀉的發(fā)生也呈現(xiàn)一定的季節(jié)性。浙江省及周邊地區(qū)PEDV檢出率在11月到次年4月期間比其余時(shí)間段高出48%。這可能是由于浙江省及周邊地區(qū)在這一時(shí)間段內(nèi)天氣比較寒冷、晝夜溫差較大。研究表明，冠狀病毒在低溫條件下比暴露于高熱或陽光條件下更穩(wěn)定[17]，因此，寒冷的天氣可能有利于PEDV的存活。

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圖2 用鄰接法構(gòu)建的基于S蛋白的PEDV分子進(jìn)化樹Fig.2 PEDV molecular evolutionary trees constructed by neighbor-joining method based on S protein

圖3 PEDV的S蛋白序列中Asn-X-Ser/Thr（X為除Pro外的任何氨基酸）和Asn的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction ofAsn-X-Ser/Thr(X is any amino acid except Pro)andAsn N-glycosylation sites within PEDV S protein

豬流行性腹瀉病毒的S蛋白被認(rèn)為具有較高的遺傳變異性[18]，不僅免疫原性良好[19-20]，而且在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中起著重要作用[12,21]。針對(duì)S基因全長進(jìn)行的遺傳變異分析，可將PEDV分為3個(gè)群[5]。對(duì)臨床分離毒株及疫苗株的S基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，疫苗株均位于Ⅱa亞群，而2012年以后的大部分PEDV分離株均位于Ⅲ群，包括本次獲得的16份PEDV陽性樣品，這些浙江及周邊地區(qū)的陽性樣品與中國常用疫苗株CV777、2010年韓國疫苗株SM98、2009和2011年韓國疫苗株強(qiáng)弱毒株DR13親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。PEDV新的變異株也無明顯的地理分布差異，這也部分解釋了基于CV777或SM98等經(jīng)典毒株的現(xiàn)有疫苗不能很好地控制當(dāng)前PEDV變異株的流行。至于S基因的變異是否能導(dǎo)致PEDV毒力增強(qiáng)，還有待于進(jìn)一步研究。S蛋白為Ⅰ型跨膜糖蛋白，富含N-糖基化修飾位點(diǎn)。盡管流行株與中國常用的PEDV CV777疫苗株大部分預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)一致，但流行株由于突變產(chǎn)生了3個(gè)新的N-糖基化位點(diǎn)并破壞了1個(gè)糖基化位點(diǎn)。流行毒株與CV777（JN599150.1，1994，中國）疫苗毒株之間N-糖基化位點(diǎn)的變化是否會(huì)影響病毒本身的致病性及抗原性，值得進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

綜上所述，PEDV是當(dāng)前引起仔豬腹瀉的主要病原，且在冬季的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他季節(jié)，呈現(xiàn)一定的季節(jié)性。雖然迄今為止PEDV只有1個(gè)血清型，但是不同毒株之間基因差異較大[22-24]。對(duì)浙江省及周邊地區(qū)的16份PEDV陽性樣品及參考株S基因的分析表明，目前在我國廣泛流行的PEDV毒株與以往的毒株相比已經(jīng)發(fā)生了較為明顯的變異，這可能也是免疫失敗的重要原因。因此，防控豬流行性腹瀉需要注意季節(jié)的波動(dòng)，也需要加快流行株疫苗的開發(fā)。

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