拮抗金黃色葡萄球菌的海綿共附生微生物的篩選及鑒定

曾臻 譚強來 (通訊作者)

（廈門醫(yī)學院 福建 廈門 361023）

海洋共附生微生物的次級代謝產(chǎn)物常具有天然類藥性，是篩選新型藥物的寶庫[1]，是否具有抑菌活性是典型指標之一[2]。韋榮編等人分離了東海海綿共附生微生物并篩選活性次級代謝產(chǎn)物[3]。林敏等人從海水、海泥樣中分離出29株具有抑菌活性的海洋細菌[4]。因此，本文擬通過傳統(tǒng)培養(yǎng)技術分離、純化海綿樣品中共附生微生物，并對拮抗金黃色葡萄球菌的活性菌株進行篩選，為挖掘海洋微生物寶庫提供基本素材。

1.材料與方法

1.1 材料

海綿、金黃色葡萄球菌、E.coli DH5α由本實驗室收集或保存，Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體購自大連寶生物，海水、LB培養(yǎng)基購自北京索萊寶，基因組DNA提取試劑盒購自北京天根。

1.2 海綿共附生微生物的分離和純化

海綿與無菌PBS混合勻漿，梯度稀釋后涂布海水培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h，觀察菌落生長狀態(tài)，挑取典型單菌落分離和純化。

1.3 拮抗篩查實驗

以金黃色葡萄球菌為敏感指示菌用紙片法篩查。分離純化的菌株接種于海水培養(yǎng)基，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)72h，過濾得發(fā)酵液備用；金黃色葡萄球菌37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)16h，按1%的量與溫熱LB固體培養(yǎng)基混勻；凝固后貼入無菌紙片，加入發(fā)酵液；37℃培養(yǎng)16h，觀察抑菌效果。

1.4 16S rDNA菌株鑒定

挑選拮抗陽性菌株進行16S rDNA鑒定。提取細菌基因組DNA，以27f和1492r通用引物PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格，TA克隆，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選陽性克隆，上海生工測序。測序結果經(jīng)NCBI Blast同源性比對鑒定。

2.結果

2.1 菌株分離

經(jīng)海水培養(yǎng)基篩選，根據(jù)菌落的典型形態(tài)特征分類，共分離純化得到7株細菌。

2.2 拮抗篩查

經(jīng)紙片法篩查，其中編號為“2-10”的菌株對金黃色葡萄球菌有較強的拮抗作用（圖1）。

2.3 測序鑒定

16S rDNA測序，經(jīng)同源性比對，與登錄號“AB308441.1”匹配度為99%，經(jīng)鑒定為Bacillus pumilus（短小芽孢桿菌）。

圖1 紙片法篩查7株細菌對金黃色葡萄球菌的拮抗作用

3.討論

海洋共附生微生物由于協(xié)助宿主生長代謝或提供化學保護，常具有更豐富的代謝途徑，從而產(chǎn)生更多活性產(chǎn)物。尹慢慢等人分離出14株具有較高抑菌活性的發(fā)形霞水母共附生細菌[5]。作者前期也曾從噴喘苔海綿中篩選分離出25株共附生微生物[6]。與其他生物相比，海洋微生物種類多、生長周期短、菌種易選育，更具有潛在產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢。因此，本文從海綿共附生微生物中篩選并鑒定出一株強拮抗金黃色葡萄球菌的短小芽孢桿菌，具有較高的研究和應用價值，為進一步開發(fā)海洋微生物藥物奠定了基礎。