瓊脂糖凝膠尿免疫固定電泳高蛋白尿標本稀釋作用的探討

譚鴻霞 黃健云 吳曉枝

（中山市小欖人民醫(yī)院檢驗科 廣東 中山 528415）

尿本周蛋白是診斷和監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的重要標志物，同時也是多發(fā)性骨髓瘤引起腎功能損傷及療效預后的關鍵指標[1]。MM是常見的一種伴有繼發(fā)性腎臟病變的疾病，所致腎臟損害的發(fā)生率為60%～90%，其中50%的病例首發(fā)癥狀是蛋白尿或腎功不全來就診[2]。尿本周蛋白的檢測方法有熱沉淀法、免疫比濁法、免疫電泳法，但這些方法的影響因素較多，其特異性和敏感性不夠，檢出率低。瓊脂糖免疫固定電泳技術是一種利用蛋白電泳和抗原抗體相結合的一種特異性、敏感性及分辨率高的鑒別單克隆免疫球蛋白的方法，比骨髓細胞學檢出更早，有利于多發(fā)性骨髓瘤的早期診斷[3]。瓊脂糖免疫固定電泳是一種分子篩分離技術，樣本濃度的高低對結果的準確性有重要的影響。日常工作中常遇到尿蛋白偏高的樣本，這些標本由于蛋白含量太高，各區(qū)帶堆積一起不能分區(qū)，且α區(qū)帶由于含量太高而易被洗脫，由此給結果的判讀帶來極大的困惑或漏診，給病人的診治有可能造成損害。廠家操作說明書上有提到如何濃縮樣本卻沒有提到對于這些高蛋白樣本該如何處理，才能做出準確的結果的說明。很多MM患者早期是以頑固性腎病蛋白尿為首發(fā)癥狀就診的，尿蛋白偏高（尿常規(guī)蛋白≥3+或尿24小時蛋白定量≥2.0～4.0g/L）是常見癥狀之一。為此，我們研究了合理稀釋對高蛋白尿瓊脂糖免疫固定電泳結果準確的重要性。本試驗擬對20例尿本周蛋白偏高的樣本，分別對其進行稀釋前與稀釋后的瓊脂糖免疫固定電泳結果比較，探討合理稀釋對結果準確可靠的重要性。

1.材料與方法

1.1 標本來源

20例高蛋白尿標本均來自我院2017年3月—2017年12月的住院病人，其中男性14例，女性6例。尿蛋白定性檢測：患者空腹晨尿，利用全自動尿干化學分析儀及配套試劑進行尿蛋白的檢測。24小時尿蛋白者按相關要求留取24小時尿。

1.2 儀器與試劑

主要儀器與試劑（1）尿蛋白采用Iris IQ200全自動尿液分析系統(tǒng)及其原裝配套試劑檢測（尿干化學批號7204190A）；（2）24小時尿蛋白采用羅氏Cobas8000全自動生化分析儀及其原裝配套試劑檢測（TPUC尿液腦脊液總蛋白檢測試劑，批號33644801）；（3）瓊脂糖尿免疫固定電泳采用法國Se-bia公司生產的試劑盒HY-DRAGEL9BENCEJONES（批號04048/01），帶抗血清免疫球蛋白（批號07028/01系列）。采用EPSON PERFECTION V700 PHOTO掃描儀來完成全套工作步驟，以獲取分析所用的電泳圖譜膠片。

1.3 方法和步驟

尿蛋白定性≥3+或24小時蛋白定量2.0～4.0g/L判斷為高蛋白尿。選20份高蛋白尿標本進行瓊脂糖免疫固定電泳，步驟如下：根據(jù)實驗的預先設置，把同一高蛋白尿樣本進行原倍和去離子水對倍稀釋后進行比對試驗，其后步驟均依照操作說明進行。

（1）選擇2/4BJ-UP電泳程序；（2）在ELP、GAM、κ、λ、κ-f、λ-f各齒梳孔上加10微升樣本；（3）用濾紙吸去堿性緩沖瓊脂糖膠片上多余的液體；（4）加200微升蒸餾水于框面下1/3處；（5）將點樣板分別放于3，9位置，按啟動健；（6）經過電泳后，依次加入ELP、GAM、κ、λ、κ-f、λ-f抗體；（7）將厚濾紙覆于凝膠上，吸去多余的抗血清；（8）烘干；（9）脫色－染色-顯色；（10）掃描電泳圖譜。

1.4 結果與判讀

ELP泳道相當于血清蛋白電泳，在結果判斷中起對照作用，以對照標本蛋白的電泳圖樣。其余5個泳道各自用相應的抗血清GAM、κ、λ、κ-f、λ-f進行免疫固定：GAM泳道加入抗IgG、IgA、IgM3種免疫球蛋白重鏈的混合抗血清，該泳道出現(xiàn)克隆帶即提示3種免疫球蛋白的其中1種呈克隆增生。κ和λ泳道加入抗結合型和游離型輕鏈的混合抗血清，標本中只要有克隆性的輕鏈（與重鏈結合或游離于血中）存在，該泳道即出現(xiàn)克隆條帶。κ-f和λ-f泳道加入抗游離輕鏈抗血清，該泳道出現(xiàn)克隆條帶提示標本中有單克隆游離輕鏈存在。

2.結果

對倍稀釋后均獲得較滿意的結果?，F(xiàn)將對比試驗中的20例中的4例高蛋白尿瓊脂糖凝膠尿免疫固定電泳結果掃描圖譜報告如下。

圖1 原倍尿免疫固定電泳

圖2 對倍稀釋后免疫固定電泳

圖1標本1～4號與圖2標本1～4號在凝膠片上標本與對應位置均相同。

原倍尿免疫固定電泳與對倍稀釋后免疫固定電泳圖像掃描可見：

（1）1、3號標本經過稀釋后清晰可見，分別為λ型和K型，原倍標本由于高濃度原因，堆集濃染現(xiàn)象較為嚴重，不利于結果判斷；（2）2、4號標本經過稀釋后，蛋白含量比例合適，電泳圖譜清晰，可報告為無反應性；（3）經過稀釋后，由于蛋白比例合適，原2，3號標本高蛋白條帶上被洗脫而形成的蒼白區(qū)現(xiàn)象消失；（4）對倍稀釋后κ-f和λ-f游離輕鏈泳道各標本均顏色較淺。

3.討論

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法，瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，各種不同蛋白質帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，在適合的濃度中，遷移的速度不同，根據(jù)這個原理可將其分開。瓊脂糖凝膠免疫固定電泳兼有“分子篩”、“電泳”“免疫分型”的三重作用。根據(jù)電泳的原理，濃度比例合適的樣本才利于其遷移分離，當含量過高時各區(qū)帶不能分開，且α區(qū)帶由于含量太高而被洗脫。而合理稀釋后再電泳則各泳道的條帶清晰可見。從以上實驗也發(fā)現(xiàn)κ-f、λ-f條帶由于含量不高，一般不用進行稀釋，若全部不經區(qū)別地稀釋會可能將其屏蔽而漏檢，κ-f、λ-f條帶是判斷MM的標準，所以κ-f、λ-f泳道的處理非常重要[4]。日常工作中常遇到本周蛋白偏高的樣本，各區(qū)帶不能分開，由此給結果的判讀帶來極大的困惑。廠家操作說明書上有提到如何濃縮樣本，卻沒有提到對于這些高蛋白樣本該如何處理才能做出準確的結果的說明。目前，多發(fā)性骨髓瘤有上升趨勢，應該把尿本周蛋白的瓊脂糖凝膠免疫固定電泳檢測列入臨床實驗室的常規(guī)檢驗項目之中，同時要特別關注尿本周蛋白偏高且電泳結果染色堆集的樣本，要通過合理稀釋才能得出準確的實驗結果。另外還要加強多學科、多領域的合作研究，對快速準確診斷、病情檢測、預后判斷多發(fā)性骨髓瘤等疾病有重要意義。