耐鹽、低溫適生芽孢桿菌TS1、TS3的拮抗及降解纖維素活性分析

吳曉暉， 謝永麗， 陳 蘭， 柴樹芳， 趙繼麗

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院高原草地資源與生態(tài)省部共建重點實驗室，青海西寧 810016)

芽孢桿菌是一類重要的植物生長促生菌，因其能產(chǎn)生抑制病原菌生長的化合物而成為生防菌研究的熱點，芽孢桿菌拮抗活性常被作為篩選生防芽孢桿菌的重要指標(biāo)，生防菌分泌的胞外代謝產(chǎn)物可直接抑制病原物的生長、殺死病原物或形成不利于病原物的環(huán)境條件，間接抑制病原物的生長，從而促進植物生長[1-2]。同時，芽孢桿菌可通過抑制病原菌的滋生，提高飼料的衛(wèi)生品質(zhì)。因此，芽孢桿菌在生態(tài)農(nóng)業(yè)及生態(tài)畜牧業(yè)發(fā)展中具有很好的研究意義和應(yīng)用潛力。產(chǎn)生抗生素是芽孢桿菌具有拮抗作用的重要原因之一，芽孢桿菌產(chǎn)生的抗生素包括由核糖體合成的小分子細(xì)菌素[3]、非核糖體合成的肽類物質(zhì)及其他一些抗菌活性物質(zhì)。非核糖體合成的抗生素中，伊枯草菌素(Iturin)[4]、表面活性素(Surfactin)[5]及泛革素(Fengycin)[6]為主要的脂肽類化合物，其中Iturin主要抑制真菌生長，Surfactin能夠抑制細(xì)菌、病毒和支原體生長，F(xiàn)engycin可抑制絲狀真菌生長并降低作物病害的發(fā)生。部分芽孢桿菌還可產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanohydrolase)、外切葡聚糖酶(exoglucanase)、木聚糖酶(xylan)、甘露聚糖酶(β-mannanase)等纖維素活性酶，可有效降解纖維素，將纖維轉(zhuǎn)化為糖類或其他營養(yǎng)產(chǎn)物[7]。

青海省秸稈纖維素資源豐富，利用卻十分有限，若應(yīng)用芽孢桿菌分泌的纖維素酶加速對草料、秸稈木質(zhì)纖維素的降解，可使養(yǎng)分有效釋放，不僅能緩解家畜飼草料短缺，還能通過秸稈還田改善土壤的結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力、降低環(huán)境污染[8]。本研究在青海省托素湖畔駱駝蓬(PeganumharmalaL.)根圍土壤中分離篩選出2株耐鹽及低溫適生芽孢桿菌菌株，通過16S rDNA及gyrB基因序列分析鑒定菌株，測定菌株拮抗病原細(xì)菌、病原真菌活性及菌株降解纖維素活性，利用基質(zhì)輔助激光解吸附-離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析菌株產(chǎn)生脂肽類化合物的種類以期為適用高原生態(tài)環(huán)境的生物菌肥研發(fā)提供耐逆性生防芽孢桿菌菌源，為生態(tài)農(nóng)業(yè)和生態(tài)畜牧業(yè)研究提供優(yōu)質(zhì)的研發(fā)菌源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及供試菌株

試驗于2016年在青海大學(xué)高原草地資源與生態(tài)省部共建重點實驗室進行。菌株分離自青海省海西州托素湖邊駱駝蓬根圍土壤。由青海大學(xué)高原草地資源與生態(tài)省部共建重點實驗室保存。細(xì)菌NA固體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基參考Wu等方法[9]配制；真菌PDA培養(yǎng)基參考薛鵬琦等方法[10]配制；低溫1C培養(yǎng)基參考劉芳等方法[11]配制；CMC培養(yǎng)基參考張楠等方法[12]配制。擴增引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成；PCR擴增反應(yīng)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.2 菌株分子鑒定

1.2.1 16S rDNA序列分析鑒定 16S rDNA序列擴增引物為正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增條件為95 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min[13]。將16S rDNA擴增產(chǎn)物回收純化后測序，測序所得序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，并采用MEGA 3.1軟件[14]對分離芽孢桿菌及模式菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.2gyrB基因序列分析鑒定gyrB基因擴增引物序列為正向引物UP1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNG GNGGNAARTTYGA-3′，反向引物UP2r：5′-AGCAGGGTAC GGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。PCR擴增條件為95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 8 min[15]。將gyrB基因擴增產(chǎn)物純化測序，所測序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，并采用MEGA 3.1軟件[14]對分離芽孢桿菌及模式菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3 菌株耐逆性測定

1.3.1 耐鹽性測定 將供試菌株分別接種到含NaCl濃度梯度分別為3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12 h，吸取50 μL菌液涂板于相應(yīng)的固體LB培養(yǎng)基上，置于37 ℃下培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)5 d后，每天觀察菌落生長情況并記錄菌株的耐鹽特性[15]。

1.3.2 耐低溫測定 用滅菌牙簽挑取供試菌株長勢優(yōu)良的單菌落接種到低溫1C液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12 h，吸取 10 μL 菌液接種于1C固體培養(yǎng)基平板上，設(shè)置18、14、10、4 ℃ 等4個溫度梯度進行培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。每天觀察菌落生長情況，測定菌株的耐低溫特性[15]。

1.4 菌株拮抗活性測定

1.4.1 拮抗病原真菌活性 分別在油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麥赤霉菌(FusaHumgraminearumSehw)、瓜類枯萎病菌(Fusariumoxysporum)的PDA平板邊緣打取直徑為0.7 cm的菌碟，接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊 2.5 cm 處，呈“十”字形分布的4個接種點上放置直徑為 4 mm 的濾紙小圓片，將供試芽孢桿菌在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)14 h后，吸取5 μL菌液接種于濾紙片上，每個處理重復(fù)3次，放入26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后取出，觀察并記錄供試芽孢桿菌抑制病原真菌生長的結(jié)果[16]。

1.4.2 拮抗病原細(xì)菌活性 將大白菜軟腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum)菌懸液與冷卻到50 ℃左右的NA培養(yǎng)基按體積比1 ∶30混勻，制成含菌平板，在距離平板中心2.5 cm處，呈“十”字形分布的4個接種點上分別放置直徑為4 mm的濾紙小圓片。將供試菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)14 h后，吸取5 μL菌液接種于濾紙片上，每個處理重復(fù)3次。置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3 d，觀察并記錄供試芽孢桿菌抑制病原細(xì)菌生長的結(jié)果[16]。

1.5 脂肽類化合物的測定及分析

1.5.1 脂肽類化合物粗提 將供試菌株TS1、TS3單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩活化，將菌液以3%的接菌量轉(zhuǎn)接于Landy培養(yǎng)基中，30 ℃發(fā)酵38 h，發(fā)酵條件參見王帥等方法[17]。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物在200 r/min的條件下離心2 min取上清，在上清液中加入6 mol/L HCl調(diào)pH值至2.0，輕微攪動，置于 4 ℃ 冰箱中過夜培養(yǎng)。離心收集沉淀，加入甲醇，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，再次用甲醇抽提并混合抽提液，獲得脂肽類化合物粗提物[17]。

1.5.2 脂肽類化合物活性測定 在血(羊血)平板距中央2.5 cm處，呈“十”字形分布的4個接種點上，放上直徑為 4 mm 的濾紙小圓片，取待測脂肽類化合物粗提物5 μL點在濾紙片中央，試驗以甲醇點在濾紙片中央為對照，每個處理重復(fù)3次。將血平板放入26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察透明圈大小并記錄透明圈直徑[14]。

1.5.3 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析 利用基質(zhì)輔助激光解吸附-離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析菌株Landy發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類化合物種類，基質(zhì)為α-氰-4-羥肉桂酸。

1.6 解纖維素活性分析

在CMC-Na篩選培養(yǎng)基平板呈“十”字形分布的4個接種點上，放置直徑為4 mm的濾紙小圓片。將供試菌株置于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)12 h后，取待測菌液5 μL點在濾紙片中央，每個處理重復(fù)3次，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，將革蘭氏碘液注入并淹沒平板表面，靜置4 min倒去染液，觀測并記錄試驗結(jié)果。若菌株將培養(yǎng)基中的纖維素大分子降解為小分子糖類，即可在濾紙片周圍觀察到圓形的透明圈。測定并記錄透明圈直徑、菌落直徑，并計算兩者比值A(chǔ)[15]。

1.7 木聚糖酶活性測定

將芽孢桿菌菌液以2%的接菌量轉(zhuǎn)接至CMC誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)48 h；將培養(yǎng)液在 4 000 r/min、4 ℃下離心10 min，上清液即為粗酶液[17]。取滅菌的2 mL離心管，加入200 μL 1%木聚糖(均溶于pH值7.0 PBS)作為反應(yīng)底物(測定各菌株的木聚糖酶活性)，將各反應(yīng)底物在37 ℃金屬浴上保溫。吸取200 μL上述稀釋至合適濃度的粗酶液與底物渦旋混合，37 ℃金屬浴 30 min；加入 500 μL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑終止反應(yīng)，并于沸水中煮沸 5 min，冷卻后，加入1 mL ddH2O；吸取反應(yīng)液至分光光度計中測定吸光度D540 nm；按照繪制的木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算反應(yīng)液中對應(yīng)還原糖的含量，扣除粗酶液和底物中所含的還原糖含量，計算得出各菌株木聚酶活性[18]。1 min 催化生成1 μmol還原糖為1個酶活性單位，記作1 U。每個樣品測定3次，取平均值[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分子鑒定

以菌株TS1、TS3基因組DNA為模板擴增16S rDNA片段，擴增到大小約1 500 bp的特征性條帶。將測序結(jié)果在NCBI中與Gen Bank中的己知序列進行Blast比對，比對結(jié)果見表1。菌株TS1與萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)BKS1-45的16S rDNA序列相同(或一致)性為99%；菌株TS3與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)JS的16S rDNA序列相同(或一致)性為100%。

以菌株TS1、TS3基因組DNA為模板擴增gyrB基因片段，擴增到大小約1 300 bp的PCR特征性條帶。將PCR產(chǎn)物純化后測序，將測序結(jié)果在NCBI中用Blast軟件與Gen Bank中己知序列進行比較，比對結(jié)果表明，菌株TS1與萎縮芽孢桿菌LSSC3的gyrB基因序列相同(或一致)性為99%；菌株TS3與解淀粉芽孢桿菌FZB42的gyrB基因序列相同(或一致)性為100%。

通過16S rDNA及gyrB基因測序分析，最終將菌株TS1鑒定為萎縮芽孢桿菌，菌株TS3鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

表1 菌株的16S rDNA及gyrB序列比對結(jié)果

2.2 菌株的抗逆性

2.2.1 菌株抗鹽性 菌株TS1、TS3耐鹽性測定結(jié)果見表2，菌株TS1、TS3均可在添加3%、5%、7%、9% NaCl的LB培養(yǎng)基上生長良好，在含NaCl濃度為13%的培養(yǎng)基上，菌株TS1可緩慢生長，菌株TS3無法生長；在含NaCl濃度為15%的培養(yǎng)基上，菌株TS1、TS3均不能生長，2株菌株顯示出良好的耐鹽性，菌株TS1耐鹽性略高于菌株TS3。

2.2.2 菌株低溫適生性 分別測定菌株TS1、TS3在18、14、10、4 ℃低溫條件下的生長情況。結(jié)果(表2)顯示，在18、14 ℃ 條件下，菌株TS1、TS3生長良好，在培養(yǎng)1 d后均長出菌苔；在10 ℃條件下，菌株TS1生長良好、菌株TS3緩慢生長，菌株TS1表現(xiàn)出更強的擴展性，培養(yǎng)1 d后即可出現(xiàn)明顯的菌苔，菌株TS3培養(yǎng)2 d后長出菌苔；在4 ℃低溫條件下，菌株TS1可緩慢生長，在培養(yǎng)3～4 d后出現(xiàn)菌苔，菌株TS3無法生長。2株菌株均表現(xiàn)出良好的低溫適生性，菌株TS1表現(xiàn)出更好的低溫適生性。

表2 菌株的耐鹽性及低溫適生性

注：+++表示生長良好；++表示正常生長；+表示緩慢生長；-表示不能生長。

2.3 菌株的拮抗活性

2.3.1 抑病原真菌活性 以油菜菌核菌、瓜類枯萎病菌及小麥赤霉菌為指示菌來檢測菌株拮抗病原真菌活性。結(jié)果(圖1、表3)表明，菌株TS1、TS3對油菜菌核病菌抑菌圈直徑≥13 mm，對瓜類枯萎病菌抑菌圈直徑 ≥10 mm，對小麥赤霉菌抑菌圈直徑≥15 mm，表現(xiàn)出良好的拮抗活。

2.3.2 抑病原細(xì)菌活性 以大白菜軟腐病菌為指示菌檢測菌株拮抗病原細(xì)菌的活性。檢測結(jié)果(圖1、表3)表明，菌株TS3對病原細(xì)菌的拮抗活性較為明顯，其拮抗大白菜軟腐病菌的抑菌圈直徑為13 mm；而菌株TS1拮抗大白菜軟腐病病原細(xì)菌的抑菌圈直徑為8 mm，菌株TS3表現(xiàn)出更高的拮抗活性。

2.4 脂肽類化合物的鑒定

脂肽類化合物是芽孢桿菌產(chǎn)生的最主要的抗菌物質(zhì)[20-21]，芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物分子量在900～2 000 bp 中范圍內(nèi)[22]。選擇菌株TS1、TS3通過Landy發(fā)酵獲得脂肽類化合物，對脂肽類化合物粗提物進行MALDI-TOF-MS分析。MALDI-TOF-MS圖譜顯示，菌株TS1在質(zhì)荷比(m/z)為1 030.92、1 044.83、1 058.92處有離子峰出現(xiàn)，這3個離子峰均對應(yīng)于Surfactin的分子質(zhì)量；在m/z為1 435.17、1 513.67 處有離子峰出現(xiàn)，這2個離子峰均對應(yīng)于Fengycin的分子質(zhì)量。菌株TS3在m/z為1 030.75、1 044.75、1 058.83 處有離子峰出現(xiàn)，這3個離子峰均對應(yīng)于Surfactin的分子質(zhì)量；在m/z為1 133.42處有離子峰出現(xiàn)，這個離子峰對應(yīng)于IturinA的分子質(zhì)量。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析結(jié)果表明，菌株TS1能產(chǎn)生脂肽類化合物Surfactin、Fengycin，菌株TS3能產(chǎn)生脂肽類化合物Surfactin、IturinA。推斷拮抗菌株抑制病原真菌及病原細(xì)菌生長可能與其產(chǎn)生抗菌作用的脂肽類化合物有關(guān)。

表3 芽孢桿菌抑菌活性特征

注：+表示抑菌圈直徑大于等于0 mm小于等于5 mm；++表示抑菌圈直徑大于5 mm小于等于10 mm；+++表示抑菌圈直徑大于10 mm小于等于15 mm；++++表示抑菌圈直徑大于15 mm。表4同。

2.5 脂肽類化合物抗生素活性分析

2.5.1 血平板試驗 通過血平板檢測菌株TS1、TS3產(chǎn)生的脂肽類化合物的抗生素活性。結(jié)果(圖2-A、表4)顯示，2株菌株提取的脂肽類化合物粗提物可在血平板上形成透明圈，其中菌株TS1形成的透明圈直徑為11.5 mm，菌株TS3形成的透明圈直徑為 14.0 mm，表明菌株TS1、TS3產(chǎn)生的脂肽類化合物具有抗生素活性，可通過與紅細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層相互作用形成離子通道，破壞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引起血細(xì)胞死亡。

2.5.2 抑病原細(xì)菌活性 測定菌株TS1、TS3產(chǎn)生的脂肽類化合物對病原細(xì)菌大白菜軟腐病的拮抗活性。結(jié)果(圖2-B、表4)顯示，脂肽類化合物在含菌平板上產(chǎn)生抑菌圈，其中菌株TS3產(chǎn)生的脂肽類化合物粗提物對病原細(xì)菌的抑菌效果非常明顯，抑菌圈直徑為16 mm，表明脂肽類化合物具有明顯的抑制病原細(xì)菌的活性，推測菌株的拮抗活性與其產(chǎn)生的脂肽類化合物有關(guān)。

表4 生防菌株產(chǎn)生的脂肽類化合物活性檢測

2.6 降解纖維素活性

2.6.1 降解纖維素活性 檢測菌株TS1、TS3降解纖維素活性。結(jié)果(圖2-C、表5)顯示，在CMC-Na固體培養(yǎng)基上，菌株TS1、TS3均可產(chǎn)生透明圈，表明菌株可利用培養(yǎng)基中的唯一碳源CMC-Na，并將其降解形成降解透明圈，更確切的說是菌株可產(chǎn)生纖維素活性酶，將CMC培養(yǎng)基中的CMC-Na進行酶促降解，使其革蘭氏碘液染色后無法附著染料而形成透明圈，通過透明圈直徑的大小可以初步反映降解纖維素活性的大小。菌株TS1、TS3產(chǎn)生的降解纖維素透明圈直徑分別為23、17 mm，A值分別為3.15、2.33，表現(xiàn)為明顯的降解纖維素活性。

2.6.2 菌株產(chǎn)木聚糖酶活性的測定 酶活性計算公式為酶活性(U/mg)=(葡萄糖含量×稀釋倍數(shù)×5.56)/反應(yīng)液中酶加入量×?xí)r間)。酶活性測定結(jié)果(表5)表明，菌株TS1酶活性值為116.76 U/mL，菌株TS3的酶活性值為 150.12 U/mL。

表5 菌株解纖維素活性測定及酶活測定

3 結(jié)論與討論

青藏高原極地環(huán)境微生物資源具有十分廣闊的研究和開發(fā)前景。芽孢桿菌是一類重要的植物根圍促生菌及生防菌，與植物之間存在有益的互作關(guān)系。芽孢桿菌通過多途徑機制與植物相互作用，刺激植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性，抑制植物病害發(fā)生、促進植物生長，是生物農(nóng)藥和生物肥料研發(fā)和應(yīng)用的理想菌源[23]。芽孢桿菌可通過非核糖體肽途徑合成具有抑真菌、細(xì)菌、病毒、菌原體等生物活性的脂肽類化合物和聚酮化合物，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用潛力[24]。與營養(yǎng)細(xì)胞相比，芽孢桿菌的抗逆芽孢壁中有皮質(zhì)層，對高溫、紫外線及抗菌素等具有很強的抗性，可以耐受飼料加工、飼料儲藏和牲畜胃的酸性環(huán)境，飼用后在腸道酸性環(huán)境中具有高度的穩(wěn)定性，在畜牧業(yè)及飼料產(chǎn)業(yè)中同樣具有重要的應(yīng)用價值[25-28]。

本研究從青海省托素湖畔駱駝蓬根圍土壤中分離篩選到耐鹽耐低溫芽孢桿菌TS1、TS3，具有明顯的拮抗植物病原細(xì)菌和病原真菌活性，Landy發(fā)酵法提取到菌株TS1、TS3的脂肽類化合物；MALDI-TOF-MS分析結(jié)果表明，菌株TS1可產(chǎn)生脂肽類化合物Surfactin、Fengycin，菌株TS3可產(chǎn)生脂肽類化合物Surfactin、IturinA，推測芽孢桿菌的拮抗活性與其產(chǎn)生的脂肽類化合物有關(guān)。CMC法測定結(jié)果表明，菌株TS1、TS3具有降解纖維素活性，2株菌株可在以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基上形成降解透明圈，具有解纖維素活性，其酶活性分別達(dá)到116.76、150.12 U/mL。菌株TS1可在4 ℃低溫條件下生長，菌株TS3在10 ℃溫度條件下和含NaCl濃度為11%的LB平板上生長，表明2株菌株具有明顯的耐鹽、耐低溫適生特性。目前，耐鹽菌是具有重要研究開發(fā)價值的微生物資源，耐鹽菌的耐鹽基因分離及耐鹽機制研究，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境修復(fù)等方面均有應(yīng)用潛力；同時，也可研發(fā)耐鹽生物菌肥，改良鹽堿地土壤。本研究分離篩選的菌株TS1、TS3具有拮抗病原真菌和病原細(xì)菌活性及纖維素降解活性，具有一定的耐鹽及低溫適生特性，適應(yīng)高原生態(tài)環(huán)境，可作為適應(yīng)高原氣候條件的耐鹽耐低溫生物菌肥和生物農(nóng)藥的研發(fā)菌源，此外，在飼料加工生產(chǎn)及作物秸稈還田領(lǐng)域具有一定的研究潛力。