豐富環(huán)境干預(yù)對帕金森病大鼠中腦miR-133b表達(dá)的影響

許容娟 蒲蜀湘 莊順芝 李芳 高聰 龍友明 姚海燕

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州 510260）

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性減少，臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢步態(tài)異常。目前PD的治療手段包括藥物治療和手術(shù)治療，但效果差強(qiáng)人意。豐富環(huán)境（enriched environment，EE）是指在動物飼養(yǎng)環(huán)境中增加體力活動、軀體感覺及視覺輸入、社交活動的實驗?zāi)Ｐ停?］。研究表明EE通過影響神經(jīng)元的可塑性，對亨廷頓氏舞蹈病、阿爾茲海默病等多種神經(jīng)退行性疾病有益［2-3］。有研究顯示微小RNA（microRNA，miRNA）廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，miR-133b在中腦多巴胺神經(jīng)元中特異性表達(dá)，且對中腦多巴胺能神經(jīng)元的成熟、存活起重要作用［4-5］。本研究旨在通過探討EE干預(yù)對PD大鼠中腦miR-133b表達(dá)的影響，進(jìn)而闡明EE治療PD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 PD大鼠模型的制作SPF級雄性Wistar大鼠（購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）36只，體質(zhì)量200～250 g，經(jīng)反復(fù)確認(rèn)無旋轉(zhuǎn)行為，隨機(jī)均分為PD模型組和假手術(shù)（sham）組。大鼠稱重，予10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀。予備皮、常規(guī)消毒、開顱后，行大鼠左側(cè)紋狀體損毀手術(shù)［6］。參照大鼠腦立體定位圖譜，坐標(biāo)為：第一點：前囟前0.3 mm，矢狀線左側(cè)旁開2.6 mm，硬膜下4.5 mm；第二點：前囟前0.7 mm，矢狀線左側(cè)旁開2.6 mm，硬膜下6.0 mm。以微量注射器將10 μL 4 g/L的6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）（以含0.1%壞血酸的生理鹽水配制）緩慢注射入PD模型組大鼠上述兩點，每點注射完畢后留針10 min。sham組大鼠予相同部位注射相同體積含0.1%壞血酸的生理鹽水。3周后，對大鼠予腹腔內(nèi)注射阿撲嗎啡（apomorphine，APO），劑量為0.5 mg/kg，觀察大鼠自開始旋轉(zhuǎn)30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。旋轉(zhuǎn)速度＞7 r/min者為成功的PD模型。

1.2 實驗分組將造模成功的PD模型組大鼠隨機(jī)分成2組：PD+EE組、PD+標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（standard environment，SE）組。將sham組大鼠隨機(jī)分成2組：sham+EE組、sham+SE組。各組動物分別予對應(yīng)環(huán)境干預(yù)。

1.3 不同環(huán)境干預(yù)EE為體積為60 cm×50 cm×100 cm的鋼絲籠，分上下3層，每層以階梯連通，內(nèi)設(shè)滾輪、秋千、管道等設(shè)施，并置入不同形狀和顏色的玩具，定期更換玩具種類、數(shù)量、位置?；\中大鼠可自由進(jìn)食飲水。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境為32 cm×20 cm×15 cm的普通鼠籠，籠內(nèi)大鼠可自由進(jìn)食飲水。將各組動物分別置入對應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)，6周后，各組取6只大鼠進(jìn)行酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫組化染色檢測損毀側(cè)紋狀體TH陽性纖維及黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞的表達(dá)，其余大鼠用于提取中腦黑質(zhì)RNA檢測miR-133b表達(dá)情況。

1.4 標(biāo)本處理

1.4.1 主要試劑及儀器抗酪氨酸羥化酶抗體（德國Millipore公司）、UltrasenitiveTMS-P超敏試劑盒（鼠/兔）（邁新試劑公司）、MirVanaTMmiRNA試 劑 盒（Thermo life technologies）、Thermoscript RT-PCR system試劑盒（Thermo life technologies）、RNase Inhibitor（Thermo Fisher Scientific）、SYBR?qPCR Mix（ToYoBo）、Rotor-GeneQ 實時熒光定量PCR分析儀（德國QIAGEN公司）。

1.4.2 TH免疫組化染色大鼠麻醉后，先經(jīng)心臟灌注生理鹽水100 mL，再予4%多聚甲醛溶液灌注30 min。灌注完畢后取腦，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，之后依次置入10%、20%、30%蔗糖溶液脫水。取中腦行冠狀切片，片厚30 μm。將切片按以下步驟行TH免疫組化染色：（1）切片入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑30 min；（2）動物非免疫血清（羊）封閉30 min；（3）兔抗TH多克隆抗體（1∶10 000）室溫孵育1 h后，4℃孵育過夜；（4）生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG室溫孵育2 h；（5）鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫孵育30 min；（6）DAB顯色。上述各步驟間均用PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。每只大鼠各取紋狀體、黑質(zhì)相同部位腦片3張，通過Leica顯微鏡采集圖像，以Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計紋狀體TH陽性纖維灰度值及黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.4.3 組織分離、RNA提取及質(zhì)量檢測不同環(huán)境干預(yù)6周后，各組大鼠麻醉后取腦，冰上、顯微鏡下分離左側(cè)中腦黑質(zhì)組織。按MirVanaTMmiRNA試劑盒說明書步驟，提取大鼠黑質(zhì)RNA?？俁NA轉(zhuǎn)移至RNase free EP管，加入80 μL預(yù)熱至95℃的RNasefree water，1 000 g離心30 s，取濾液加入1 μL RNase Inhibitor，放于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?.5 μL RNA樣品，用微量分光光度計檢測RNA濃度，要求OD260/280值在1.8～2.1之間，并以電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對各組大鼠的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在RNase free的PCR管中加入總RNA 11 μL、RNase free H2O 1 μL，吹打均勻，置于80 ℃保溫5 min，65℃保溫5 min，使RNA變性，隨后立即4℃冷卻，防止RNA復(fù)性。向上述PCR管加入10 mmol/L dNTPs 2 μL、5 × Buffer 4 μL、0.1 mol/L DTT 1 μL、RNase out 1 μL、RT（script）1 μL，反應(yīng)條件為65℃ 45 min，85℃ 5 min，最后4℃冷卻，-20℃保存。

1.4.5 實時熒光定量PCR選用U6snRNA為內(nèi)參照。20 μL PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 1.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，2×SYBR Green qPCR SuperMix 10 μL，RNase-free water 7.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃復(fù)性30 s，60℃延伸30 s，45個循環(huán)；融解曲線分析：溫度60～95℃。每個樣本重復(fù)3次。采用比較Ct值法分析miR-133b相對表達(dá)量（F=2-△△Ct）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件分析，定量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析。兩兩比較，滿足正態(tài)分布和方差齊性數(shù)據(jù)采用student t檢驗，不滿足正態(tài)分布或方差齊性數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同環(huán)境干預(yù)下PD大鼠損毀側(cè)（左側(cè)）紋狀體TH陽性纖維灰度值及黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目測定PD+SE組大鼠損毀側(cè)紋狀體TH陽性纖維灰度值、黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目少于sham+SE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.643，P ＜0.05；t=-18.002，P＜0.05）。PD+EE組大鼠損毀側(cè)紋狀體TH陽性纖維灰度值、黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目較PD+SE組多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.373，P ＜ 0.05；t=4.208，P＜0.05）。sham+EE組大鼠損毀側(cè)紋狀體TH陽性纖維、黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目較sham+SE組多（t=-4.490，P ＜ 0.05；t=6.845，P ＜ 0.05）。見表1和圖1、2。

表1 各組大鼠中腦損毀側(cè)（左）紋狀體TH陽性纖維灰度值和黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目比較（n=6）Tab.1 Comparison of expression of TH-positive fiber in striatum and TH-positive cells in substantia nigra ±s

表1 各組大鼠中腦損毀側(cè)（左）紋狀體TH陽性纖維灰度值和黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目比較（n=6）Tab.1 Comparison of expression of TH-positive fiber in striatum and TH-positive cells in substantia nigra ±s

組別sham+EE組sham+SE組PD+EE組PD+SE組紋狀體TH陽性纖維灰度值3.778 5±0.212 2 2.837 3±0.467 4 1.671 1±0.480 3 1.009 1±0.485 7黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)（個）459.50±37.09 346.67±15.95 184.17±24.31 123.17±25.89

圖1 各組大鼠紋狀體TH染色Fig.1 Tyrosine hydroxylase immunohistochemistry staining in striatum

2.2 不同環(huán)境干預(yù)下的PD大鼠中腦黑質(zhì)miR-133b的表達(dá)情況PD+SE組大鼠損毀側(cè)中腦黑質(zhì)miR-133b相對表達(dá)量高于sham+SE組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.868，P＜0.05）。PD+EE組大鼠損毀側(cè)中腦黑質(zhì)miR-133b的相對表達(dá)量低于PD+SE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.948，P＜0.05）。見圖3、4。

圖2 各組大鼠黑質(zhì)TH染色Fig.2 Tyrosine hydroxylase immunohistochemistry staining in substantia nigra

圖3 PD+SE組、sham+SE組大鼠中腦miR-133b相對表達(dá)量Fig.3 MiR-133b relative expression in mibrain of rats in PD+SE and sham+SE group

圖4 PD+EE組、PD+SE組大鼠中腦miR-133b相對表達(dá)量Fig.4 MiR-133b relative expression in mibrain of rats in PD+EE and PD+SE group

3 討論

EE是一個有著復(fù)雜的物理性刺激和社會刺激的復(fù)合體，設(shè)置EE的總原則是要增加自主物理運動和社會刺激。目前EE的概念已被廣泛運用到環(huán)境對腦功能的影響研究中。研究表明，EE在缺血性腦損傷、阿爾茲海默病、抑郁等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起積極作用［7］。JUNGLING 等［8］在大鼠出生后即予5周EE干預(yù)，在大鼠成年后予6-OHDA模擬PD的病理生理狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出生后予EE干預(yù)的動物黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損失略少于對照環(huán)境組，盡管沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，但進(jìn)一步的行為學(xué)檢查表明EE干預(yù)可對抗6-OHDA造成的運動功能減退，在一定程度上提示早期EE干預(yù)對晚期PD可能存在神經(jīng)保護(hù)作用。然而在PD晚期的EE干預(yù)的作用，在不同的研究中存在差異。STEINER等［9］先對大鼠予6-OHDA處理建立PD模型，隨后予EE干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干預(yù)4和7周后，PD模型大鼠的運動功能得到改善，但對6-OHDA造成的多巴胺能神經(jīng)元退化沒有影響。TH是多巴胺合成的限速酶，是腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，在多巴胺生成的調(diào)節(jié)中起重要作用。因此，本研究采用TH免疫組化染色檢測大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的表達(dá)情況。本研究中，PD組大鼠損傷側(cè)紋狀體TH陽性神經(jīng)纖維及黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞較假手術(shù)組減少，模擬了PD中黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元減少的病理狀態(tài)。并且，EE干預(yù)的PD大鼠中腦TH陽性纖維及TH陽性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)較PD+SE組增多，這與前述STEINER等［9］的研究存在差異，但與ANASTASíA等［10］的研究結(jié)果相一致。在ANASTASíA等［10］的研究中，對大鼠進(jìn)行6-OHDA處理的前后均予3周EE干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EE干預(yù)可使PD大鼠黑質(zhì)紋狀體通路得到保護(hù)，運動損害也減少。不同研究間存在差異的原因可能與建立PD模型時6-OHDA的用量、注射的部位以及EE干預(yù)的時機(jī)有關(guān)。本研究表明EE上調(diào)了PD大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的表達(dá)，證實在PD晚期的EE干預(yù)具有神經(jīng)修復(fù)作用，為PD晚期的臨床治療提供了一種新的策略。

盡管EE在基因、分子、行為學(xué)水平上對多種疾病具有積極的影響，其作用機(jī)制目前仍未十分明確。miRNA是由內(nèi)源性基因編碼、長度約20～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA［11］。miRNA對基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和神經(jīng)細(xì)胞表型調(diào)控起重要作用，廣泛參與神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程［5，12-13］。研究表明，PD患者腦脊液中miRNA的表達(dá)與正常人群相比存在顯著差異，多個miRNA的異常表達(dá)被認(rèn)為與PD相關(guān)［14-15］。KIM等［11］對PD患者尸檢發(fā)現(xiàn)，在PD患者中腦、皮層、小腦中，miR-133b表達(dá)減少。KIM等［11］進(jìn)一步的體外實驗表明，敲除miR-133b能夠上調(diào)多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)，miR-133b與調(diào)控多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育和成熟的轉(zhuǎn)錄因子Pitx3存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)回路。然而，與KIM等［11］在組織水平上的研究不同的是，SCHLAUDRAFF 等［16］利用優(yōu)化的單細(xì)胞定量實時PCR技術(shù)，對散發(fā)性PD患者和正常對照者的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元分析發(fā)現(xiàn)，兩者miR-133b水平并無差異。研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠miR-133b對中腦多巴胺神經(jīng)元數(shù)量及Pitx3表達(dá)無明顯影響，小鼠的運動及認(rèn)知行為也無改變［11］。馬孝俊等［17］發(fā)現(xiàn)，PD 患者腦脊液中 miR-133b表達(dá)升高。本研究中，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境干預(yù)的PD大鼠黑質(zhì)miR-133b的相對表達(dá)水平高于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境干預(yù)的假手術(shù)對照組大鼠，表明6-OHDA的神經(jīng)毒性作用可能與miR-133b有關(guān)，可能引起miR-133b表達(dá)上調(diào)而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性。在不同的研究中，miR-133b與PD的關(guān)系尚存爭議。推測原因可能在于：（1）miR-133b的旁系同源物miR-133a1和miR-133a2的存在可能補(bǔ)償了miR-133b的失調(diào)；（2）在體內(nèi)miR-133b失調(diào)與PD病因?qū)W之間缺乏因果關(guān)系，但miR-133b的水平可能影響多巴胺能神經(jīng)元對神經(jīng)毒素介導(dǎo)的神經(jīng)變性的易感性；（3）miR-133b在PD的不同時期的水平可能存在差異［16，18］。EE 干預(yù)下的 PD 大鼠損傷側(cè)黑質(zhì) miR-133b相對表達(dá)水平較標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境干預(yù)下的PD大鼠低，提示EE干預(yù)可能通過抑制miR-133b的表達(dá)，促進(jìn)黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元修復(fù)，由此實現(xiàn)在PD晚期中的神經(jīng)修復(fù)作用。關(guān)于EE如何影響腦組織中miRNA表達(dá)的變化，目前的研究很少。在關(guān)于抑郁癥的研究［19］中，發(fā)現(xiàn)EE可影響miR-107、miR-134等miRNA的表達(dá)，提示miRNA的表達(dá)譜在EE下發(fā)生變化。特定miRNA的累積依賴于轉(zhuǎn)錄、加工和衰變的速率。因此，EE對miRNA表達(dá)譜的影響可能與基因轉(zhuǎn)錄、miRNA轉(zhuǎn)換率或兩者均相關(guān)。EE如何下調(diào)miR-133b的表達(dá)尚不清楚。DENHAM等［20］發(fā)現(xiàn)，運動訓(xùn)練降低人全血中miR-133家族的水平。在EE中，體力活動是重要的組成要素之一。因此，EE可能通過增加骨骼肌代謝的蛋白質(zhì)合成和改善氧化能力、胰島素敏感性和線粒體生物合成使miR-133b下降。JIN 等［21］發(fā)現(xiàn)，lncRNA133b，一種長 鏈 非編碼RNA，其下調(diào)增加miR-133b的表達(dá)，而其過表達(dá)則降低miR-133b的表達(dá)。因此，EE通過上調(diào)lncRNA133b表達(dá)以下調(diào)miR-133b是另一種可能的解釋。此外，MARGOLIS等［22］研究發(fā)現(xiàn)，限制能量攝入可上調(diào)血清miR-133b表達(dá)。因此，能量代謝的變化可能是解釋EE下調(diào)miR-133b表達(dá)的另一個突破口。miR-133b可能是EE作用的潛在的靶標(biāo)，通過直接干預(yù)miR-133b的表達(dá)或調(diào)整影響miR-133b表達(dá)的因素，可能模擬EE的神經(jīng)修復(fù)作用，這可能為臨床PD晚期的治療提供一種新的可能的思路。

盡管本研究的結(jié)果揭示了miR-133b可能是EE的神經(jīng)修復(fù)作用潛在的靶標(biāo)，但兩者之間具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。