轉錄因子FoxO1對神經母細胞瘤侵襲遷移和上皮-間質轉化的影響及其機制

何霞 劉銘

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒外科（四川瀘州646000）

神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童常見腫瘤性疾病，起源于胚胎期神經嵴細胞。NB具有很高異質性，由于腫瘤生長迅速、易轉移及惡性程度高等特點［1］，導致臨床治療效果不佳。目前NB治療主要包括手術、放療、化療、造血干細胞移植和誘導分化等治療手段，但出現轉移的患者生存率極低［2-3］。因此，探究影響神經母細胞瘤轉移的分子機制對于提高生存及預后具有重要意義。

FoxOs轉錄因子家族包括FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，影響細胞增殖、凋亡和細胞分化等生物學行為，在生長發(fā)育過程中起到重要作用［4］。FoxOs家族在哺乳動物大腦發(fā)育過程中廣泛表達［5］，最新研究［6］發(fā)現FoxOs家族在神經元極性發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。FoxO1功能失調在多種腫瘤疾病中均有發(fā)現，DONG等［7］發(fā)現FoxO1抑制肝癌侵襲轉移及上皮-間質轉化。此外，FoxO1在胃癌［8］、肺癌［9］及惡性膠質瘤［10］等腫瘤性疾病中發(fā)揮抑制侵襲轉移的功能。然而，FoxO1對NB侵襲轉移及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響確未曾報道，同時其潛在的分子機制未知，因此本研究通過體外實驗探究FoxO1對神經母細胞瘤細胞侵襲轉移及上皮-間質轉化的影響并揭示其機制，為NB靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人神經母細胞瘤細胞系IMR-32和SHSY5Y購自中國科學院昆明細胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；FoxO1過表達慢病毒和FoxO1 shRNA慢病毒購自上海吉瑪公司，FoxO1 shRNA序列：5′-CCGGGCCTGTTATCAATCTGCTAAACTCGAGTTTAGCAGATTGATAACAGGCTTTTTG-3′。FoxO1和E-cadherin單克隆抗體購自美國abcam公司，N-cadherin、Vimentin和ZEB2單克隆抗體購自美國CST公司，GAPDH多克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及慢病毒轉染人神經母細胞瘤細胞系IMR-32和SH-SY5Y分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基，加入100 μg/mL 的青霉素/鏈霉素，細胞置于 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每隔2～3天進行細胞換液，待細胞生長至80%～90%密度時使用胰酶消化離心，進行細胞傳代培養(yǎng)。FoxO1過表達和FoxO1 shRNA慢病毒預實驗感染確定IMR-32和SH-SY5Y細胞MOI值，加入5 μg/mL的polybrene和相同病毒數慢病毒轉染細胞，放置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入2～3 μg/mL嘌呤霉素篩選3周，使用qRT-PCR和免疫印跡法（Western-blot）檢測FoxO1 mRNA和蛋白表達情況，確定轉染及篩選效率。

1.3 siRNA細胞轉染細胞正常消化離心，1.0×105/孔接種于6孔板內，調節(jié)siRNA濃度為20 μmol/L，轉染前使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液清洗細胞，按X-treme GENE HP siRNA Transfection Reagent說明書將無血清培養(yǎng)基、siRNA或對照組Control siRNA及轉染試劑混合靜置15 min后轉染細胞，繼續(xù)細胞培養(yǎng)48 h檢測轉染效率。

1.4 Transwell細胞遷移和侵襲實驗胰酶消化對數生長期的細胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數并調整濃度為1.5×105/mL，下室加入800 μL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，上室加入200 μL無血清細胞懸液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小室用PBS清洗后使用4%多聚甲醛固定20 min，再置于0.1%的結晶紫溶液中染色30 min，取出用PBS清洗，并用棉簽擦掉上室未穿膜的細胞，隨機挑選5個不同視野于100倍光學顯微鏡下拍照并計數穿膜細胞數。

侵襲實驗前4～6 h使用matrigel基質膠50 μL包被濾膜孔徑為8 μm的Transwell小室，并放置于培養(yǎng)箱。細胞侵襲實驗參照遷移實驗進行鋪板，計數并調整濃度為2.0×105/mL，48 h后染色記錄并拍照。

1.5 qRT-PCR檢測mRNA表達細胞正常消化離心按4.0×105/孔接種于6孔板，進行不同細胞處理。PBS清洗細胞3遍，加入細胞裂解液并置于冰上1 min，使用上海飛捷生物RNA提取試劑盒提取不同處理總RNA，紫外分光光度計進行定量。按照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒說明進行反轉錄獲得cDNA，mRNA表達檢測使用TaKaRa SYBR@PrimixEx TaqTMⅡ反應體系，FoxO1上游引物序列為：5′-TCGTCATAATCTGTCCCTACACA-3′，下游引物序列為：5′-CGGCTTCGGCTCTTAGCAAA-3′；ZEB2上游引物序列為：5′-CAAGAGGCGCAAACAAGCC-3′，下游引物序列為：5′-GGTTGGCAATACCGTCATCC-3′。使用GAPDH作為內參，上游引物序列為：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。mRNA的表達水平采用2-△△Ct計算方法進行分析。

1.6 免疫印跡法（Western blot）檢測相關蛋白表達細胞胰酶消化離心后傳代，4.0×105/孔種于6孔板內進行不同處理。取出并棄去上清，用PBS沖洗3遍加入細胞裂解液并置于冰上靜置1 min，刮下裂解物并轉移至1.5 mL離心管，震蕩混勻30 s，冰上靜置10 min。15 000 r/min離心15 min，吸取上清總蛋白。留取5 μL定量，加入6×Loading buffer后于沸水中煮沸5 min進行蛋白變性處理。30 μg蛋白上樣，使用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，110 V×2 h轉膜至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，置于特定一抗4℃搖床上孵育過夜。使用TBST洗膜液10 min×3次，置于相應的二抗，常溫搖床慢速孵育1 h，10 min×3次洗膜后使用ECL顯影液進行顯影，目的蛋白表達量通過與內參蛋白GAPDH標準化后得到相對比值。

1.7 統(tǒng)計學方法應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理數據，數據以均數±標準差表示，組間差異采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 過表達FoxO1抑制細胞侵襲轉移能力使用FoxO1過表達慢病毒感染IMR-32細胞，構建FoxO1過表達穩(wěn)轉細胞系，通過Western blot（圖1A）和qRT-PCR（圖1B）檢驗FoxO1蛋白和mRNA表達，成功構建FoxO1過表達細胞系。使用Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力改變（圖1C、圖1D），IMR-32細胞對照組遷移和侵襲細胞數分別為（187±5.438）和（278±10.343），IMR-32過表達FoxO1組遷移和侵襲細胞數分別為（96±7.970）和（147±9.564），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），表明FoxO1過表達抑制IMR-32細胞侵襲轉移能力。

圖1 IMR-32細胞系過表達FoxO1侵襲轉移能力減弱Fig.1 Overexpressed FoxO1 in IMR-32 cells decreased the metastasis ability

2.2 敲低FoxO1增強細胞侵襲轉移能力使用FoxO1敲低慢病毒感染SH-SY5Y細胞，構建FoxO1敲低穩(wěn)轉細胞系，通過Western blot（圖2A）和qRT-PCR（圖2B）檢驗FoxO1蛋白和mRNA表達，成功構建FoxO1敲低細胞系。Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力改變（圖2C、圖2D），SH-SY5Y細胞對照組遷移和侵襲細胞數分別為（81±11.232）和（197±14.890），SH-SY5Y敲低FoxO1組遷移和侵襲細胞數分別為（165±18.697）和（328±16.768），結果差異存在統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），說明敲低FoxO1促進SH-SY5Y細胞侵襲轉移。

2.3 FoxO1抑制神經母細胞瘤上皮-間質轉化使用Western blot檢測IMR-32過表達FoxO1細胞系和SH-SY5Y敲低FoxO1細胞系上皮-間質細胞標志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達，結果發(fā)現FoxO1穩(wěn)定過表達后細胞發(fā)生間質-上皮轉化，E-cadherin蛋白水平上調而N-cadherin和Vimentin蛋白水平下調（圖3A、圖3B）；FoxO1穩(wěn)定敲低后細胞發(fā)生上皮-間質轉化，E-cadherin蛋白水平下調而N-cadherin和Vimentin蛋白水平上調（圖3C、圖3D），結果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 FoxO1通過抑制ZEB2表達調節(jié)神經母細胞瘤上皮-間質轉化IMR-32過表達FoxO1細胞系和SH-SY5Y敲低FoxO1細胞系檢測ZEB2 mRNA（圖4A）和蛋白（圖4B）水平變化，發(fā)現FoxO1抑制ZEB2 mRNA和蛋白表達，結果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。為了驗證FoxO1通過調節(jié)ZEB2影響神經母細胞瘤上皮-間質轉化，本實驗使用siRNA敲低SH-SY5Y細胞系ZEB2表達，使用Westernblot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達，發(fā)現ZEB2敲低條件下FoxO1引起的上皮-間質轉化作用減弱，提示FoxO1通過影響ZEB2表達發(fā)揮功能。

圖2 SH-SY5Y細胞系敲低FoxO1侵襲轉移能力增強Fig.2 Knock-down FoxO1 in SH-SY5Y cells increased the metastasis ability

圖3 FoxO1抑制神經母細胞瘤細胞上皮-間質轉化Fig.3 FoxO1 inhibited EMT of neuroblastoma cells

3 討論

神經母細胞瘤是兒童常見的惡性腫瘤，易發(fā)生早期轉移，導致臨床治療頗具困難，目前常用的手術治療、化療、放射治療及移植治療等手段仍不能有效控制腫瘤進展，因此探究NB轉移分子機制對于提高預后具有重要指導意義。

FoxO1蛋白在多種腫瘤中存在低表達，其上游受到PI3K/AKT信號通路調節(jié)，下游靶向調控與細胞增殖、細胞凋亡及侵襲轉移等相關性基因表達，FoxO1在胰島素/胰島素樣生長因子信號通路中發(fā)揮重要功能［11］。FoxO1含量及活性受到多種因素調節(jié)，作為轉錄因子可以被上游調控分子磷酸化，磷酸化FoxO1從胞核轉移至胞漿中，失去靶向激活下游靶基因的功能［12］。MEI等［13］發(fā)現在神經母細胞瘤中FoxO1/3/4通過影響PDGFRA調節(jié)NB細胞分化，本研究發(fā)現FoxO1在NB侵襲遷移中發(fā)揮重要功能，通過過表達和敲低NB細胞FoxO1表達，發(fā)現FoxO1過表達抑制NB侵襲遷移能力，而敲低FoxO1促進NB侵襲遷移能力。腫瘤轉移是造成NB患者死亡的重要因素，而EMT在侵襲遷移發(fā)生過程中起到重要作用。EMT發(fā)生過程中，組織良好和連接緊密的上皮細胞轉化為組織松散和缺乏細胞連接的間質細胞［14］，并且具有轉移和侵襲的能力。本研究同時檢測上皮-間質標志物發(fā)現過表達FoxO1抑制NB細胞上皮-間質轉化的發(fā)生，而敲低FoxO1促進NB細胞上皮-間質轉化的發(fā)生，說明FoxO1在NB中作為抑癌基因調控其侵襲轉移及上皮-間質轉化的發(fā)生。

圖4 FoxO1通過抑制ZEB2表達調節(jié)神經母細胞瘤上皮-間質轉化Fig.4 FoxO1 regulated EMT of neuroblastoma cells through inhibiting the expression of ZEB2

ZEB2（zinc-finger E-box binding homebox 2，ZEB2）在多種腫瘤如大腸癌［15］、胃癌［16］及乳腺癌［17］等促進腫瘤侵襲轉移的發(fā)生。ZEB2能與E-cadherin編碼基因啟動子上的E2盒結合抑制E-cadherin轉錄功能［18］，從而促腫瘤侵襲轉移。此外，研究發(fā)現肝癌肺轉移組織中ZEB2存在過表達，且肝癌組織中FoxO1和ZEB2表達存在明顯負相關性［7］。為了探究FoxO1抑制NB侵襲轉移及EMT的分子機制，本研究檢測FoxO1對ZEB2表達的影響，結果發(fā)現FoxO1過表達ZEB2表達下調而FoxO1敲低后ZEB2表達升高，提示FoxO1可能通過調節(jié)ZEB2表達發(fā)揮抑制腫瘤功能。為了研究假設，本實驗在FoxO1敲低細胞系基礎上再次敲低ZEB2，通過檢測上皮間質標志物發(fā)現雙基因敲除后E-cadherin和N-cadherin變化明顯減弱，提示FoxO1通過抑制ZEB2表達發(fā)揮功能。

綜上所述，本研究率先發(fā)現并驗證FoxO1抑制NB侵襲遷移和上皮-間質轉化，同時發(fā)現FoxO1抑制ZEB2表達是其可能的分子機制，對于NB轉移研究提供新思路。本研究主要通過體外實驗研究FoxO1蛋白的功能，缺乏體內研究證據，在今后研究中會增加體內實驗驗證FoxO1蛋白的功能并進一步探討其影響ZEB2表達的分子機制，有可能為轉移性NB的綜合治療帶來新的靶點。