應(yīng)用原代軟骨細(xì)胞與SW1353軟骨肉瘤細(xì)胞系建立體外骨關(guān)節(jié)炎模型的效果評(píng)價(jià)

劉曉彤，黃悅，劉旭丹，徐小磊，姜夢(mèng)琪，楊迎春，何健宜，顧海倫，劉莉*

（1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，沈陽(yáng) 110100；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110004）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritlis，OA）又稱退行性骨關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨退變及繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要特征[1]，在人群中的發(fā)病率及致殘率均較高[2]。OA的危險(xiǎn)因素主要包括年齡、性別、肥胖、關(guān)節(jié)損傷等[3]，但其具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，且無有效的根治方法。關(guān)節(jié)軟骨的變化被認(rèn)為是OA發(fā)生發(fā)展過程中最主要的病理過程[4]，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的唯一細(xì)胞成分，其合成分泌的II型膠原及蛋白多糖是組成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，且在維持軟骨功能方面發(fā)揮決定作用。研究表明，OA時(shí)軟骨細(xì)胞基質(zhì)減少、功能衰退[5]。因此，對(duì)于軟骨細(xì)胞的研究是探討OA的發(fā)病機(jī)制、尋找有效防治措施的必要手段。

軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)是了解軟骨細(xì)胞生物學(xué)性狀的重要方法[6]。目前，針對(duì)OA的體外實(shí)驗(yàn)研究大多采用原代細(xì)胞或細(xì)胞系來進(jìn)行[7,8]，如正常軟骨細(xì)胞、OA軟骨細(xì)胞或軟骨肉瘤細(xì)胞系（如SW1353細(xì)胞系）等。但以上細(xì)胞在作為OA體外實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象時(shí)，細(xì)胞的病理變化及對(duì)炎癥的反應(yīng)程度存在一定的差異。因此，本研究通過比較白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）處理下，來源于OA患者的原代軟骨細(xì)胞及SW1353軟骨肉瘤細(xì)胞系的增殖活力、OA的炎癥標(biāo)志性產(chǎn)物白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13 ，MMP-13）表達(dá)水平、炎癥反應(yīng)信號(hào)通路的核因子 -κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表達(dá)水平的異同，建立與評(píng)估不同來源的體外OA模型，為OA的體外實(shí)驗(yàn)研究中細(xì)胞的選擇提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 原代軟骨細(xì)胞及SW1353軟骨肉瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)

取 8例因 OA 行膝、髖關(guān)節(jié)置換的患者關(guān)節(jié)軟骨組織（男 4 例、女 4 例，患者年齡 32～81歲，經(jīng)某三甲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)、患者知情同意），采用胰酶（0.25 %）、Ⅱ型膠原（0.08 %）兩步消化，200目篩網(wǎng)過濾分離，培養(yǎng)關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至第3代使用；SW1353細(xì)胞系購(gòu)置于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。均使用低糖DMEM培養(yǎng)基（10% FBS、1% 青鏈霉素），于37℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 主要儀器與試劑

主要儀器：超凈工作臺(tái)（成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（上?？凭x器公司）；倒置顯微鏡（日本OlymPus 公司）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）； 7500 Real-Time PCR儀（美國(guó)ABI公司）

主要試劑：IL-1β（美國(guó)PeProTech）；DMEM（美國(guó)Hyclone）；FBS（美國(guó)CLERK）；Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Invitrogen）；胰蛋白酶（美國(guó)GIBCO）；Ⅱ型膠原一抗（中國(guó)博士德）；SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Trizol（大連寶生物工程有限公司）；CCK-8（日本東仁）；ELISA 試劑盒（中國(guó)博士德）；PCR擴(kuò)增試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

3 原代軟骨細(xì)胞爬片及表型鑒定

第2代關(guān)節(jié)原代軟骨細(xì)胞融合至80%～90%，消化傳代至預(yù)先放入無菌蓋玻片的直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞約融合50%左右，進(jìn)行表型鑒定。Ⅱ型膠原檢測(cè)（免疫細(xì)胞化學(xué)法）：細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定20min；3% H2O2孵育10min；正常山羊血清室溫孵育15min，一抗4℃過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育15min；H2O2-DAB 呈色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。蛋白多糖檢測(cè)（甲苯胺蘭染色法）：細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定20min，1% 甲苯胺藍(lán)染色30min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶（0.25%）消化后制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μl（約含細(xì)胞數(shù)2000個(gè)）。原代細(xì)胞分組如下：對(duì)照組（CON組）、IL-1β（10ng/ml）組，分別處理24h、48h及72h；SW1353細(xì)胞分組如下：CON組、IL-1β（1、10、20、40ng/ml）組，處理24h。酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。

5 IL-6、MMP-13 水平和 NF-κB mRNA 表達(dá)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，待融合至80%～90%后，加藥處理，分組如下：CON組、IL-1β（10ng/ml）組。收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清，-80℃保存待測(cè)。IL-6、MMP-13水平的ELISA法測(cè)定：根據(jù)ELISA說明書按步驟進(jìn)行。

NF-κB mRNA表達(dá)水平的Real-time PCR檢測(cè)：提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行，多聚酶鏈反應(yīng)（總反應(yīng)體系20μl：2×SYBR Premix Ex Taq II 10μl、10μmol/L 的上下游引物各 0.8μl、50×Rox Reference DyeII 0.4μl、cDNA 2μl、ddH2O 6μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30s 1 個(gè)循環(huán)；PCR 反應(yīng)95℃5s，60℃34s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析 95℃15s，60℃1min，95℃15s，1個(gè)循環(huán)）。數(shù)據(jù)分析：β-actin 作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析采用 2-ΔΔCt分析法。引物序列如下：NF-κB（218bp）上 游 5’-AGGAGAGGATGAAGGAGTTGTG-3’， 下游 5’-CCAGAGTAGCCCAGTTTTTGTC-3’；β-actin（101bp）上游5’-CACACTGTGCCCATCTACGA-3’，下游 5’-CTCAGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT-3’。

6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。兩組比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組比較時(shí)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 原代軟骨細(xì)胞表達(dá)II型膠原蛋白并呈甲苯胺藍(lán)異染性

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：所有原代軟骨細(xì)胞均呈II膠原蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性，其胞質(zhì)呈棕黃色（圖1A）；甲苯胺藍(lán)染色顯示，所有原代軟骨細(xì)胞呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)內(nèi)含有藍(lán)紫色異染顆粒，表明其表達(dá)蛋白多糖（圖1B）

2 IL-1β降低原代軟骨細(xì)胞增殖活力

CCK-8法檢測(cè)顯示，10ng/ml IL-1β處理軟骨細(xì)胞24h后，原代軟骨細(xì)胞增殖活力顯著降低，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)（48h及72h），降低增值活力作用有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)（圖2）；而1、10、20、40ng/ml IL-1β處理SW1353細(xì)胞24h，對(duì)其增殖活力無明顯影響（圖3）。

圖1 原代軟骨細(xì)胞鑒定。A，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色；B，蛋白多糖甲苯胺藍(lán)染色；比例尺，100μmFig. 1 Identification of primary chondrocytes. A, immunocytochemical staining for type II collagen; B, toluidine blue staining for proteoglycan; scale bars, 100μm

圖2 IL-1β處理對(duì)原代軟骨細(xì)胞增殖活力的影響。與CON組相比，**P＜0.01Fig. 2 Effect of IL-1β treatment on the proliferation activity of primary chondrocytes. Compared with CON group, **P＜0.01

圖3 IL-1β處理對(duì)SW1353細(xì)胞增殖活力的影響Fig. 3 Effect of IL-1β treatment on the proliferation activity of SW1353 cells

3 IL-1β上調(diào)原代軟骨細(xì)胞與SW1353細(xì)胞IL-6、MMP-13和NF-κB表達(dá)

ELISA測(cè)定顯示，10ng/ml IL-1β處理可使原代軟骨細(xì)胞與SW1353細(xì)胞系培養(yǎng)基上清中IL-6（圖4）和MMP-13（圖5）水平均顯著升高；Real time-PCR檢測(cè)表明，10ng/ml IL-1β處理可使原代軟骨細(xì)胞和SW1353細(xì)胞系中NF-κB mRNA表達(dá)量顯著上升（圖6）。

圖4 . IL-1β處理對(duì)原代軟骨細(xì)胞及SW1353細(xì)胞分泌IL-6的影響。A，原代軟骨細(xì)胞；B，SW1353細(xì)胞；與CON組相比，**P＜0.01Fig. 4 Effect of IL-1β treatment on secretion of IL-6 in primary chondrocytes and SW1353 cells. A, primary chondrocytes; B, SW1353 cells; compared with CON group, **P＜0.01

圖5 IL-1β處理對(duì)原代軟骨細(xì)胞及SW1353細(xì)胞分泌MMP-13的影響。A，原代軟骨細(xì)胞；B，SW1353細(xì)胞；與CON組相比：*0.01＜P＜0.05；**P＜0.01Fig. 5 Effect of IL-1β treatment on secretion of MMP-13 in primary chondrocytes and SW1353 cells. A, primary chondrocytes; B, SW1353 cells;compared with CON group, *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01

圖6 IL-1β處理對(duì)原代軟骨細(xì)胞及SW1353細(xì)胞NF-κB mRNA表達(dá)的影響。A，原代軟骨細(xì)胞；B，SW1353細(xì)胞；與CON組相比：*0.01＜P＜0.05；**P＜0.01Fig. 6 Effect of IL-1β treatment on expression of NF-κB mRNA in primary chondrocytes and SW1353 cells. A, primary chondrocytes; B, SW1353 cells;compared with CON group, *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01

討 論

來源于患者的原代軟骨細(xì)胞與永生化的軟骨肉瘤細(xì)胞系都是常用于OA體外研究的細(xì)胞[9,10]，相比于細(xì)胞系，原代軟骨細(xì)胞可以更好的體現(xiàn)OA進(jìn)程中細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化、OA產(chǎn)物及通路等的表達(dá)變化，但來源不易、且分離步驟較煩瑣，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，原代軟骨細(xì)胞基本爬滿培養(yǎng)瓶瓶底需兩周左右。SW1353細(xì)胞系優(yōu)點(diǎn)就在于增殖活力強(qiáng)、較易獲得和易于培養(yǎng)等（如本實(shí)驗(yàn)中，SW1353細(xì)胞系基本爬滿培養(yǎng)瓶瓶底只需48 h ～72 h），但由于其是腫瘤細(xì)胞系，表型、特性等方面的代表性較原代細(xì)胞差。

由于本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞提取自患者關(guān)節(jié)組織，可能混有骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，而II型膠原主要是由軟骨細(xì)胞特異性分泌的，因此，為鑒別我們所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為軟骨細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)選用免疫細(xì)胞化學(xué)法與甲苯胺藍(lán)染色法分別檢測(cè)細(xì)胞中Ⅱ型膠原與蛋白多糖的表達(dá)。結(jié)果顯示Ⅱ型膠原與蛋白多糖表達(dá)均呈陽(yáng)性，說明本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的原代細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。

體外實(shí)驗(yàn)中，常用IL-1β做誘導(dǎo)劑來模擬OA炎癥環(huán)境[11]。為探討IL-1β對(duì)原代軟骨細(xì)胞及SW1353細(xì)胞系的增殖活力的影響，我們采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，IL-1β（10 ng/ml）處理不同時(shí)間均可顯著抑制原代軟骨細(xì)胞增殖活力，但抑制作用并未隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)， 這與Li等人的研究結(jié)果相同，即 IL-1β（10 ng/ml～25 ng/ml）作用6h～48h后可抑制原代軟骨細(xì)胞增殖活力[12]。但不同濃度IL-1β處理下，對(duì)SW1353細(xì)胞增殖活力卻無明顯影響，Ji[13]等人研究也顯示IL-1β（5 ng/ml）處理24 h對(duì)SW1353細(xì)胞增殖活力無明顯影響的結(jié)果一致。這可能是由于作為腫瘤細(xì)胞系，SW1353細(xì)胞本身的增殖活力很強(qiáng)，掩蓋了IL-1β對(duì)其增殖活力的抑制作用。

IL-6的升高往往預(yù)示著炎癥反應(yīng)加重[14]，而MMP-13合成及活性的上調(diào)均可引起Ⅱ型膠原在OA中的過度裂解[15]，是反映關(guān)節(jié)軟骨退變程度的重要標(biāo)志物[16,17]。本研究結(jié)果顯示，IL-1β處理后原代軟骨細(xì)胞與SW1353細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和MMP-13的表達(dá)量均顯著增加，提示IL-1β可誘導(dǎo)原代軟骨細(xì)胞及SW1353細(xì)胞出現(xiàn)OA樣炎癥反應(yīng)。對(duì)于SW1353細(xì)胞來說，雖然IL-1β并不能引起細(xì)胞增殖活力的抑制，但卻可顯著增加炎癥因子的表達(dá)，說明IL-1β作為體外OA模型的誘導(dǎo)劑一樣適用于SW1353細(xì)胞系。在本研究中還發(fā)現(xiàn)，原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的表達(dá)量要高于SW1353細(xì)胞系，這有可能是由于本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞取自O(shè)A患者，細(xì)胞本身已經(jīng)處于炎癥環(huán)境。

NF-κB是一種廣泛參與免疫炎癥反應(yīng)進(jìn)程的核蛋白因子，調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，同時(shí)還可促進(jìn)多種炎癥因子，如IL-1β、MMPs的合成與分泌，在OA進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用[18,19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1β處理可使原代軟骨細(xì)胞與SW1353細(xì)胞中NF-κB mRNA的表達(dá)量均顯著升高，提示IL-1β可通過激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)原代軟骨細(xì)胞與SW1353細(xì)胞系發(fā)生OA炎癥反應(yīng)。可推測(cè)，雖然兩種細(xì)胞炎癥反應(yīng)程度存在差異，但引起炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能相同。

綜上所述，IL-1β可誘導(dǎo)原代軟骨細(xì)胞及SW1353細(xì)胞系出現(xiàn)OA炎癥反應(yīng)，但在細(xì)胞增殖活力、炎癥因子的表達(dá)等方面依然存在一定差異。研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募翱陀^條件選擇不同的細(xì)胞作為研究OA的體外模型。