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    泥鰍消化道過氧化物酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及非特異性酯酶的分布與組織定位

    2018-11-07 02:37:28曹新芳黃卉卉任秋楠陳婷婷王靜張盛周
    關(guān)鍵詞:后腸中腸胃體

    曹新芳,黃卉卉,任秋楠,陳婷婷,王靜,張盛周

    (安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蕪湖 241000)

    泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)別稱魚鰍、泥鰍魚,隸屬鯉形目鰍科泥鰍屬,常棲息于湖泊、池塘、水田的淤泥表層或緩流水中,繁殖速度快,適應(yīng)性強(qiáng),是一種雜食性小型魚類,主要攝食水生昆蟲、甲殼類、幼螺等底棲無脊椎動(dòng)物和各種藻類、植物碎片等[1,2]。泥鰍肉質(zhì)鮮美,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和補(bǔ)氣養(yǎng)腎等藥用價(jià)值,其蛋白降解產(chǎn)物還具有抗氧化作用,深受人們的喜愛,有“水中之參”的美稱[2,3]。

    近年來,隨著泥鰍的市場需求量不斷增加,人們對泥鰍的人工養(yǎng)殖技術(shù)及其相關(guān)基礎(chǔ)理論的研究也在不斷深入開展。劉孝華等[2]對泥鰍的生物學(xué)特性和人工養(yǎng)殖方法進(jìn)行了描述和研究;胡廷尖等[4]通過組織學(xué)切片和顯微觀察研究了泥鰍消化道的形態(tài)特征和組織結(jié)構(gòu);陳蘇維等[5]采用生物化學(xué)方法檢測了泥鰍消化道不同部位淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。然而,泥鰍消化道黏膜中與消化吸收相關(guān)的重要酶,如過氧化物酶(POX)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)和非特異性酯酶(NSE)等的活力尚未見研究報(bào)道。本文采用酶組織化學(xué)染色對泥鰍消化道黏膜中該6種重要酶的分布及組織定位進(jìn)行研究,旨在增進(jìn)對泥鰍消化生理功能的認(rèn)識,為其人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

    材料和方法

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    鮮活人工養(yǎng)殖泥鰍9條,長15.4~18.6cm,重45.8~49.1g,購自蕪湖市黃山西路菜市場,置于清水中暫養(yǎng)2h。用鈍器敲打其頭部致暈,快速解剖取出完整消化道,在泥鰍消化道的食道、胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸、后腸等7個(gè)部位進(jìn)行精確分離取樣,樣品于0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)中漂洗干凈后,OCT包埋,進(jìn)行冷凍切片,厚度為8μm,置于-20 ℃冰箱中備用。

    2 酶組織化學(xué)染色

    6種酶的組織化學(xué)染色方法及酶反應(yīng)的底物見表1,藥品試劑的配制及實(shí)驗(yàn)操作步驟參考謝毓玲等[6]的方法進(jìn)行。

    表1 6種酶的組織化學(xué)染色方法和主要底物Tab.1 Histochemical staining techniques and main substrates of the 6 enzymes

    3 光密度測定與數(shù)據(jù)分析

    使用Olympus BX61型顯微鏡觀察酶的組織化學(xué)染色結(jié)果并拍照。利用Image-Pro Plus圖像分析軟件,對酶組織化學(xué)染色的陽性部位進(jìn)行光密度分析,測出面積(Area)和累積光密度值(IOD),并計(jì)算出平均光密度(MOD)值表示酶活力大小。在SPSS軟件中,采用單因素方差分析(One-way ANOVN)法,分別對6種酶在消化道不同部位的活力進(jìn)行兩兩比較,得出不同酶在泥鰍消化道不同部位分布的差異顯著性,P<0.05為差異顯著。

    結(jié) 果

    在光鏡下,經(jīng)組織化學(xué)染色后,泥鰍消化道黏膜6種酶均呈現(xiàn)出明顯的染色反應(yīng)。對組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行光密度測定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,得出6種酶在泥鰍消化道不同部位的活力分布(表2)。

    表2 泥鰍消化道黏膜6種重要酶的分布Tab. 2 Distribution of the 6 essential enzymes in the digestive mucosa of Misgurnus anguillicaudatus

    過氧化物酶:POX組織化學(xué)染色陽性部位呈棕褐色,顆粒狀分布。POX在食道中酶活性最高,在消化道的其余部位酶活性顯著較低(表2)。POX在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞中(圖A1);在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞基部;在腸道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞基部,固有層也有少量零星分布(圖A2)。

    三磷酸腺苷酶:ATPase組織化學(xué)染色陽性部位呈棕黑色。ATPase在胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸中酶活性較高,在食道中酶活性顯著較低(表2)。ATPase在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部;在胃賁門、胃體和胃幽門中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部(圖B1);在前腸、中腸和后腸中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣,上皮細(xì)胞的基部亦可見少量分布(圖B2)。

    琥珀酸脫氫酶:SDH組織化學(xué)染色陽性部位呈藍(lán)紫色。SDH在胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸中酶活性較高,在食道中酶活性顯著降低(表2)。SDH在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部;在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分于胃小凹黏膜上皮細(xì)胞頂部,上皮細(xì)胞基部亦有少量分布(圖C1);在前腸、中腸和后腸中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部,部分上皮細(xì)胞基部亦有少量分布(圖C2)。

    堿性磷酸酶:ALP組織化學(xué)染色陽性部位呈深藍(lán)色。ALP在胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸中酶活性較高,在食道中酶活性顯著較低(表2)。ALP在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部;在胃賁門、胃體和胃幽門中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞的頂部(圖D1);在前腸、中腸和后腸中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣(圖D2)。

    酸性磷酸酶:ACP組織化學(xué)染色陽性部位呈棕黃色。ACP在食道、胃賁門、胃體、前腸、中腸和后腸中酶活性較高,在胃幽門中酶活性顯著較低(表2)。ACP在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞中;在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞中,固有層中亦有少量分布(圖E1);在前腸、中腸和后腸中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部,固有層亦有少量分布(圖E2)。

    非特異性酯酶:NSE組織化學(xué)染色陽性部位呈磚紅色。NSE在食道、胃賁門、胃幽門、前腸、中腸中酶活性較高,在胃體和后腸中酶活性顯著降低(表2)。NSE在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的頂部和基部;在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部和基底部,固有層亦有少量分布(圖F1);在前腸、中腸和后腸中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣,上皮細(xì)胞基部和固有層中亦有少量分布(圖F2)。

    圖1 泥鰍消化道黏膜6種酶的組織化學(xué)定位。A,POX在食道(A1)和后腸(A2)的分布;B,ATPase在胃體(B1)和后腸(B2)的分布;C,SDH在胃體(C1)和中腸(C2)的分布;D,ALP在胃體(D1)和前腸(D2)的分布;E,ACP在胃幽門(E1)和中腸(E2)的分布;F,NSE在胃幽門(F1)和后腸(F2)的分布;SB,紋狀緣;ME,黏膜上皮;LP,固有層;GP,胃小凹;比例尺,50μmFig. 1 Histochemical localization of 6 enzymes in digestive tract mucosa of Misgurnus anguillicaudatus. A, distribution of POX in the esophagus (A1)and hindgut (A2); B, distribution of ATPase in the stomach corpus (B1) and hindgut (B2); C, distribution of SDH in the stomach corpus (C1) and midgut (C2); D, distribution of ALP in the stomach corpus (D1) and foregut (D2); E, distribution of ACP in the stomach pylorus (E1) and midgut (E2); F,distribution of NSE in the stomach pylorus (F1) and hindgut (F2); SB, striated border; ME, mucosal epithelia; LP, lamina propria; GP, gastric pit; scale bar, 50μm

    討 論

    泥鰍的消化道由食道、胃、前腸、中腸和后腸組成。泥鰍的胃不十分明顯,由腸管膨大形成,呈直管狀,無彎曲,屬“I”型胃[4]。本研究顯示,泥鰍胃沒有明顯的胃腺,POX、ATPase、SDH和ALP的酶活性在胃和腸道之間沒有顯著差異性,進(jìn)一步表明,泥鰍的胃分化程度較低,其黏膜的組織結(jié)構(gòu)和酶組成與腸黏膜有較高的相似性。

    POX是廣泛存在于微生物、動(dòng)植物體內(nèi)的一種氧化還原酶,具有消除細(xì)胞內(nèi)有毒代謝產(chǎn)物如過氧化氫、醛類、酚類、胺類等物質(zhì)的作用[7,8]。本研究顯示,POX主要分布于泥鰍消化道的食道,在胃和腸道中分布較少。與烏鱧(Ophiocephalus argus)[6]消化道中POX主要分布于胃賁門和胃體,食道中分布較少,存在明顯差異;與鱖魚(Siniperca chuatsi)[9]消化道中POX在腸道中分布較少相似,但鱖魚胃幽門中POX分布最多,食道中分布較少。泥鰍食道中較高的POX酶活性有利于清除食道中因頻繁吞咽活動(dòng)產(chǎn)生的較多有毒代謝廢物。POX發(fā)揮催化作用釋放的氧自由基還具有殺滅病原微生物的作用[10],因此,POX在泥鰍食道中分布較多還有利于防止外來病原微生物侵入機(jī)體,可能是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制。

    ATPase是普遍存在于細(xì)胞膜和線粒體、溶酶體等細(xì)胞器膜上的一類水解酶,能夠水解ATP并釋放能量,參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。本研究顯示,ATPase主要分布于泥鰍消化道的胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸,在食道中酶活性顯著較低。與烏鱧[6]消化道中ATPase的分布明顯不同,主要分布于烏鱧胃體,其次為胃幽門和胃賁門,在腸道中分布相對較少;鱖魚[9]消化道中ATPase主要分布于食道、胃賁門、胃體、胃幽門、前腸和后腸,在中腸分布最少,與 泥鰍消化道ATPase的分布亦存在差異。烏鱧和鱖魚胃中ATPase活性較高主要是由于其胃腺發(fā)達(dá), ATPase集中分布于胃腺,黏膜上皮細(xì)胞中分布較少,主要為胃蛋白酶和胃酸的分泌提供能量;泥鰍胃黏膜無明顯的胃腺,ATPase集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部,與腸道中ATPase主要分布于上皮細(xì)胞的紋狀緣相似,表明泥鰍的胃上皮細(xì)胞可能具有較強(qiáng)的吸收功能,泥鰍的胃和腸道均是營養(yǎng)物質(zhì)的吸收部位。

    SDH廣泛存在于線粒體內(nèi)膜,是線粒體的一種標(biāo)志酶,參與并催化三羧酸循環(huán)中琥珀酸還原為延胡索酸,酶活性可用于判斷三羧酸循環(huán)的強(qiáng)度[12]。本研究發(fā)現(xiàn),SDH在泥鰍的胃和腸道各段均分布較多,在食道中分布最少。與烏鱧[6]和鱖魚[9]消化道中SDH主要分布于胃賁門和胃體,在腸道分布較少存在顯著差異,但與兩者食道中SDH分布最少相似。烏鱧和鱖魚胃腺發(fā)達(dá),SDH集中分布于胃腺,為胃腺的分泌活動(dòng)提供足夠的能量。泥鰍沒有明顯的胃腺,胃中SDH集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部,與腸道中SDH的分布相一致,可為胃和腸道上皮細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)提供充足的ATP能量。

    ALP主要存在于細(xì)胞膜中,參與營養(yǎng)物質(zhì)如脂質(zhì)、糖類、鈣和無機(jī)磷酸鹽的吸收,可根據(jù)其分布來判斷魚類消化道中營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位[13,14]。本研究顯示,ALP在泥鰍的胃和腸道各部位活性均較高,在食道中酶活性顯著較低。與烏鱧[6]消化道中ALP主要分布于前腸和中腸,胃賁門、胃體和胃幽門分布較少不同;與許氏平鲉(Sebastes schlegelii)[15]消化道中ALP主要分布于中腸,前腸和后腸分布相對較少,食道、胃賁門和胃幽門未檢測到酶活性存在顯著差異;與半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[8]消化道中ALP主要分布于前腸,其次為后腸,胃中分布最少亦明顯不同。泥鰍消化道中ALP主要定位于胃黏膜上皮細(xì)胞頂部和腸上皮細(xì)胞的紋狀緣,進(jìn)一步表明泥鰍的胃和腸道都是營養(yǎng)物質(zhì)的吸收部位。

    ACP是存在于溶酶體的一種標(biāo)志酶,主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的消化和吸收。通過胞飲作用直接吸收蛋白顆粒然后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)消化被認(rèn)為是硬骨魚中蛋白質(zhì)消化的另一種途徑[16]。本研究顯示,ACP在泥鰍的食道、胃賁門、胃體、前腸、中腸和后腸中酶活性較高,胃幽門中酶活性顯著較低。與褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)[17]消化道中ACP主要分布于中腸,其次為食道、胃體、前腸和后腸,在胃賁門和胃幽門分布最少相似;與許氏平鲉[15]消化道中ACP在后腸和中腸中分布較多,前腸和胃賁門中相對較少,食道和胃幽門中分布最少存在不同之處;與烏鱧[6]消化道中ACP在中腸和后腸分布最高,其次為胃幽門和前腸,在胃賁門、胃體和食道分布最少則明顯不同。由此可見,ACP在魚類消化道各段的分布具有一定的物種特異性。泥鰍消化道ACP的分布表明其胃賁門、胃體和前腸具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸收和細(xì)胞內(nèi)消化功能。

    NSE參與包括魚類在內(nèi)的大多數(shù)脊椎動(dòng)物中脂肪酸甘油酯的水解,與脂質(zhì)的消化和吸收有關(guān)。由于魚類的能源物質(zhì)主要是脂質(zhì)而不是碳水化合物和蛋白質(zhì),因此,NSE對魚類獲取能源物質(zhì)尤為重要[13,18]。本研究顯示,NSE在泥鰍的食道、胃賁門、胃幽門、前腸、中腸中活性均較高,在胃體和后腸中分布較少。與項(xiàng)帶重牙鯛(Diplodus vulgaris)[19]消化道中NSE主要分布于前腸和中腸,在后腸分布最少相似;但與褐菖鲉[17]消化道中NSE在胃幽門中分布最高,其次為胃賁門、胃體,在食道和腸道中分布最少存在顯著差異;與紅娘魚(Lepidotrigla Cavillone)[20]消化道中NSE在后腸分布最多,其次為前腸,在幽門盲囊和中腸分布最少亦明顯不同。泥鰍消化道中NSE分布較為廣泛,食道、胃賁門、胃幽門和前腸中檢測到較高的酶活性,表明泥鰍消化道的前段就有較強(qiáng)的脂質(zhì)消化功能,這與魚類以脂質(zhì)為主要能源物質(zhì)相適應(yīng)。

    綜上所述,泥鰍消化道黏膜6種酶的分布同其他魚類相比,顯示出明顯的物種特異性,主要表現(xiàn)為泥鰍胃分化程度低,酶的分布和定位與腸道較為相似。本研究表明,泥鰍的胃和腸都有較強(qiáng)的吸收功能;胃賁門、胃體和前腸具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸收和細(xì)胞內(nèi)消化功能;胃賁門、胃幽門、前腸和中腸具有較強(qiáng)的脂質(zhì)消化能力。

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