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    泛素化羧基末端水解酶37在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平及意義

    2018-11-07 11:21:02鄧顯倫馮立波徐建偉向繼勇夏冬
    關(guān)鍵詞:化酶泛素緩沖液

    鄧顯倫,馮立波,徐建偉,向繼勇,夏冬

    (1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科,四川 瀘州 646000;2.四川省中江縣人民醫(yī)院 普外科,四川 中江 618100)

    2012年的數(shù)據(jù)顯示全球新發(fā)結(jié)直腸癌病例數(shù)約為140萬(wàn)[1],為導(dǎo)致腫瘤相關(guān)性死亡最主要的原因之一[2]。因此,更深入的尋找與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)的分子及潛在機(jī)制顯得有尤為迫切。泛素化羧基末端水解酶37(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37, UCH37)是去泛素化酶家族成員,其可通過(guò)從蛋白泛素連接鏈的遠(yuǎn)端亞基水解聚泛素而抑制蛋白降解[3]。研究顯示UCH37在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[4-5]。本研究擬檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本中UCH37的表達(dá)情況,并分析其臨床相關(guān)性。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    選取2010年6月-2012年12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科接受結(jié)直腸癌根治術(shù),術(shù)后病理顯示所切除的腫瘤組織為結(jié)腸癌或直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本77例。組織標(biāo)本收取后分為兩部分,一部分凍于液氮中供后續(xù)提取RNA用,一部分進(jìn)行石蠟包埋供免疫組織化學(xué)檢測(cè)用。入組患者在術(shù)后3個(gè)月后開(kāi)始隨訪(fǎng)記錄,隨訪(fǎng)截止時(shí)間點(diǎn)為患者死亡或至2016年7月本研究截止日。入組患者詳細(xì)臨床病理資料見(jiàn)表1。所有入選本次研究的結(jié)直腸癌患者術(shù)前未進(jìn)行包括放療、化療及靶向治療,術(shù)中所取腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織,經(jīng)液氮凍存或石蠟包埋長(zhǎng)期儲(chǔ)存。本研究已經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn),所有入組患者均親自簽署知情同意書(shū),授權(quán)課題組使用其組織標(biāo)本進(jìn)行本項(xiàng)科學(xué)研究。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫組織化學(xué)(簡(jiǎn)稱(chēng)免疫組化) 二甲苯脫蠟2次,100%~70%梯度酒精脫水。檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)90 s。30 ml/L過(guò)氧化氫孵育20 min,磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。兔抗人UCH37單克隆抗體(ab131244)(1∶100)4℃孵育過(guò)夜,磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入聚合物增強(qiáng)劑,37℃孵育20 min,磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。加入酶標(biāo)抗兔聚合物放大劑,37℃孵育15 min,磷酸鹽緩沖液清洗5 min×5次。DAB顯色,蘇木素復(fù)燃,1 ml/L鹽酸酒精分化,磷酸鹽緩沖液返藍(lán),脫水,透明,封片。染色結(jié)果判定每個(gè)片子隨機(jī)選取10個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及著色程度。免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師以雙盲的方式完成,兩者不一致的結(jié)果請(qǐng)上級(jí)病理醫(yī)師與兩人經(jīng)多鏡頭顯微鏡下討論得出一致結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞百分率<25%或不著色及較淡著色者為陰性,陽(yáng)性細(xì)胞百分率>25%或適中著色及深著色者為陽(yáng)性。

    1.2.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 RNA提取采用Trizol法,Trizol夠自于美國(guó)Sigma公司,將液氮冷凍過(guò)的組織研磨成粉末狀,加入1 ml Trizol繼續(xù)研磨至裂解呈透明狀。12 000 r/min 4℃離心5 min,上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿,用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15 min。吸取上清液至一新的離心管中,加入等體積異丙醇,上下顛倒15次,靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄去上清,加入75%的乙醇1 ml,12 000 r/min 4℃離心5 min。所得沉淀加入20 μl去離子水,即為所需RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用10 μl體系,RNA定量后,取1 μl RNA,加入5× Prime Script RT master(日本 TaKaRa 公司)2 μl,7 μl去離子水。輕柔混勻后,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為:37℃ 15 min RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi),逆轉(zhuǎn)錄酶工作;85℃ 5 s形成CDNA,置入4℃冰箱儲(chǔ)存。

    1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR) 采用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR,配置PCR反應(yīng)液,PCR反應(yīng)采用25 μl體系,組分如下:SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5 μl,UCH37或β-actin正向鏈引物1 μl,UCH37或βactin反向鏈引物1 μl,實(shí)時(shí)定量產(chǎn)物2 μl,去離子水8.5 μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃擴(kuò)增15 s,60℃ 延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后樣品置入4℃冰箱保存。UCH37引物序列:正向5'-TGTC TCATGGAAAGCGACCC-3',反向 5'-GCCACTTGAAAA GAAAAATTAACCC-3';β-actin引物序列:正向5'-CG TCTTCCCCTCCATCGT-3',反向 5'-GAAGGTGTGGTGC CAGATTT-3'。計(jì)算公式為:UCH37相對(duì)表達(dá)量:

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)分析用Spearman法,繪制K-M生存曲線(xiàn),比較用Log-rank χ2檢驗(yàn);影響因素的分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 UCH37 mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平

    qRT-PCR結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織中UCH37 mRNA表達(dá)水平為(5.138±1.266),癌旁組織UCH37 mRNA的表達(dá)水平為(1.325±0.519)。兩者UCH37 mRNA表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.746,P=0.043),UCH37 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。

    2.2 UCH37蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平

    UCH37的陽(yáng)性表達(dá)率在TNM Ⅰ和Ⅱ期患者為40.625%(13/32),TNM Ⅲ和Ⅳ期為 68.889%(31/45)。兩者間UCH37陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.104,P=0.019),UCH37蛋白在TNM Ⅲ和Ⅳ期結(jié)直腸癌患者組織中的陽(yáng)性率高于TNMⅠ和Ⅱ期結(jié)直腸癌患者。見(jiàn)圖1。

    2.3 UCH37的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

    圖1 UCH37蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) (×40,×200)

    表1 UCH37與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

    UCH37的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者血管侵襲情況(rs=5.729,P=0.019)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)(rs=4.364,P=0.04),而與其他病理特征無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表1。

    2.4 UCH37的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年總生存率的關(guān)系

    根據(jù)UCH37免疫組化結(jié)果,將結(jié)直腸癌患者分為UCH37陽(yáng)性組和UCH37陰性組。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)顯示,UCH37陽(yáng)性組與陰性組結(jié)腸癌患者術(shù)后五年總體生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.979,P=0.049),UCH37陽(yáng)性組的結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年總體生存率低于UCH37陰性組,見(jiàn)圖2。

    2.5 UCH37的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

    單因素分析結(jié)果顯示,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、血管侵襲及UCH37的表達(dá)水平與總體生存預(yù)期相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、血管侵襲及UCH37表達(dá)水平均為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子指標(biāo)。見(jiàn)表2。

    圖2 UCH37的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年總體生存率的關(guān)系

    表2 結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間影響因素的單因素及多因素分析Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型相關(guān)參數(shù)

    3 討論

    蛋白底物可與泛素共價(jià)性結(jié)合,而后被蛋白酶體識(shí)別并降解為小分子肽。泛素-蛋白酶體系是真核生物細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的非溶酶體途徑。去泛素化酶可水解底物蛋白上的泛素鏈之間的鏈接,從而抑制蛋白降解[6-8]。該蛋白降解調(diào)控機(jī)制參與多種的細(xì)胞生理過(guò)程,如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、增殖、分化以及腫瘤發(fā)生[9-11]。UCH37是去泛素化酶家族成員,可去泛素化Ⅰ型活化型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)受體,而使其免于被蛋白酶體降解,從而上調(diào)TGF-β依賴(lài)的基因表達(dá)[12-13]。此外,UCH37也可去泛素化Smad2和Smad3,增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性,從而間接活化TGF-β1信號(hào)通路[14]。更為重要的是,沉默UCH37的表達(dá)可活化Caspase-9和Caspase-3而有效地誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡[15]。既往研究發(fā)現(xiàn),UCH37在卵巢癌中異常高表達(dá),并可作為卵巢癌獨(dú)立判斷預(yù)后的分子指標(biāo)[16]。此外,UCH37在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào),并可與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulated protein 78, GRP78)結(jié)合而調(diào)控細(xì)胞存活[5]。另有研究發(fā)現(xiàn),UCH37可通過(guò)調(diào)控Tcf7DNA的結(jié)合而活化Wnt信號(hào)通路,從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[17]。值得注意的是,研究發(fā)現(xiàn)UCH37的選擇性去泛素化酶抑制劑WP1130可介導(dǎo)在腫瘤中激活的UCH37等去泛素化酶,從而導(dǎo)致抗凋亡蛋白的表達(dá)下調(diào),促凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)[18]。本研究均提示UCH37可能通過(guò)促進(jìn)某些原癌基因的表達(dá)而在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究的結(jié)果進(jìn)一步支持UCH37在腫瘤進(jìn)展中的促癌作用,本研究發(fā)現(xiàn)UCH37在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織,與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。生存分析結(jié)果也顯示UCH37高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者術(shù)后五年總體生存率低于低表達(dá)患者。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型結(jié)果進(jìn)一步顯示UCH37為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的分子指標(biāo)。提示UCH37在結(jié)直腸癌中可能作為癌基因發(fā)揮作用,促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與增值。

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