苦參堿調(diào)控結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥性及機制研究

王偉，鄭兵，任銳，朱濤

（四川省宜賓市第一人民醫(yī)院，普外科， 四川 宜賓 644000）

結(jié)腸癌是臨床上常見的消化道疾病之一，臨床上主要采用手術(shù)與化療聯(lián)合治療，但患者的長期生存率較低，且有時不能完全治愈，甚至化療藥物的耐藥性問題也隨著出現(xiàn)，這是臨床上結(jié)腸癌治療失敗的主要原因之一[1-2]，故研究結(jié)腸癌化療耐藥性尤為重要。研究顯示[3-6]，腫瘤對化療藥物多藥耐藥是影響結(jié)腸癌化療療效的主要因素，耐藥基因MDR1編碼調(diào)控P-糖蛋白（glycoprotein, P-gp），結(jié)腸癌細胞高表達P-gp是影響治療效果的主要障礙之一。眾多研究表明[7-9]，JNK/SAPK信號通路與腫瘤細胞的化療耐藥性密切相關(guān)，本研究將探討苦參堿（matrine, Ma）對人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細胞株（SW480/Oxa）耐藥性的影響及是否與JNK/SAPK信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌SW480細胞購自購自中科院上海細胞庫，環(huán)王巴明、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）均購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司，Annexin-V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京生物建成研究所，P-gp、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化c-Jun氨基端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase, p-JNK）、c-Jun、 磷 酸 化 c-Jun（phosphorylated c-Jun, p-c-Jun）抗體購自Abcam公司，過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ）和JNK阻斷劑 SP600125均購自美國R＆D Systems公司，Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒均購自日本TaKaRa公司，TGL-16G-A型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），7300型實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（美國Applied Biosystems公司），基礎(chǔ)電泳儀（美國Bio-Rad公司），酶標(biāo)儀（Thermo公司），EL204-電子天平（上海特勒-托多利多儀器有限公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌SW480細胞，采用RPMI 1640培養(yǎng)液[添加10%FBS，1%雙抗（鏈霉素100 u/ml，青霉素 100 u/ml）]，置于 5% 二氧化碳 CO2，37℃的培養(yǎng)箱條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 獲得性O(shè)xa耐藥結(jié)腸癌SW480細胞的建立 按照文獻[10]，首先，采用0.1 μmol/L的奧沙利鉑（oxaliplatin, Oxa）處理SW480細胞，Oxa處理后大部分細胞死亡，少量細胞存活，待存活細胞繼續(xù)生長到融合度達90%時，進行傳代3代，之后提高濃度至0.5 μmol/L的Oxa處理SW480細胞，以此方法再提高到1.0 μmol/L的Oxa處理SW480細胞，最終獲得臨床血藥濃度2.0 μmol/L，傳代5代，穩(wěn)定的耐藥細胞SW480/Oxa細胞。

1.2.3 MTT法檢測Ma給藥濃度 為選擇合適的Ma濃度進行后續(xù)實驗，首先采用MTT法檢測Ma對SW480/Oxa耐藥細胞的IC50值。取對數(shù)生長期的細胞，以2×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，分組進行實驗。加入終濃度分別為 0、1、5、10、20 及 30 μmol/L 的 Ma（含DMSO的終濃度為0.1%）；溶劑對照組調(diào)整DMSO的終濃度為0.1%；空白對照組不做任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加20 μl MTT，37℃孵育4 h，棄上清，再加入100 μl DMSO溶液，在酶標(biāo)儀上測定570 nm波長各孔吸光度A值（A570）。細胞抑制率（IR）：IR（%）=（1-處理組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的SW480/Oxa細胞，以2×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，分組與給藥：①NC組：空白對照組（細胞不做任何處理）；②Oxa組：Oxa（2 μmol/L）；③Ma+Oxa組：Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加 20 μl MTT，37℃孵育4 h，棄上清，再加入100μl DMSO溶液，在酶標(biāo)儀上測定570 nm波長各孔吸光度A值（A570）。每組設(shè)置3個復(fù)孔。細胞抑制率（IR）：IR（%）=（1-處理組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的細胞，以5×103個/ml接種于6孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。用含10%胎牛血清的RPMl l640培養(yǎng)基培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至貼壁，實驗分組與給藥同1.2.4項下，根據(jù)Annexin-V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，流氏細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 qRT-PCR檢 測P-gp、MDR1 mRNA表 達水平 參照文獻[11]，檢測P-gp、MDR1 mRNA。取對數(shù)生長期的細胞，以5×103個/ml濃度接種于6孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至貼壁，實驗分組與給藥：①NC組：空白對照組（細胞不做任何處理）；② Oxa組：Oxa（2 μmol/L）；③ Ma+Oxa 組 ：Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）；④ PPARγ+Oxa組：PPARγ（0.1 μg/L）+Oxa（2 μmol/L）；⑤ SP600125+Oxa 組：SP600125（100 μg/L）+Oxa（2 μmol/L）；⑥ PPARγ+Ma+Oxa組：PPARγ（0.1 μg/L）+Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）；⑦ SP600125+Ma+Oxa組：SP600125（100μg/L）+Ma（10 μmol/L）+Oxa（2 μmol/L）。根據(jù) Trizol試劑盒提取組織總RNA，采用核酸測定儀測定RNA純度和濃度，取1 μg進行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進行定量檢測，P-gp擴增引物序列為：P-gp，正向 5'-TACTCACGCCTCGAAACCT-3'，反向 5'-GTCTGCTTTCCTCCCTGATG-3'；MDR1，正向5'-CCC ATCATTGCAATAGCAGG-3'，反向5'-GTTCAAACTTC TGCTCCTGA。以GAPDH基因為內(nèi)參，其引物序列如下：GAPDH，正向5'-CCTAGTTCGTCATGGGTG TGAACCA-3'，反向5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGA TGTTC-3'，擴增條件及計算方法參考文獻[12]。

1.2.7 Western blot檢測P-gp、p-JNK蛋白的表達水平 參照文獻[13]。取對數(shù)生長期的細胞，以5×103個/ml濃度接種于6孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。用含10%胎牛血清的RPMl 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至貼壁，實驗分組與給藥同1.2.6項下。常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）方法測定蛋白質(zhì)含量后，進行凝膠電泳，每孔上樣20 μg，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）上后，3%的脫脂奶封閉2 h，分別孵育P-gp、p-JNK（目的蛋白）和β-actin（內(nèi)參蛋白）一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantityone軟件對條帶亮度進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ma的給藥濃度

Ma對SW480/Oxa細胞的IC50濃度為30 μmol/L?？紤]到Ma與Oxa對癌細胞可能存在協(xié)同殺傷癌作用，并且為盡量減輕高濃度藥物引發(fā)的毒副作用，選擇IC50前一濃度作為Ma濃度進行后續(xù)實驗，即選擇20 μmol/L作為后續(xù)實驗Ma的給藥濃度。見圖1。

圖1 MTT法檢測Ma給藥濃度

2.2 細胞增殖活性情況

NC組、Oxa組和Ma+Oxa組細胞增殖活性分別為（99.67±2.12）、（72.12±1.12）和（61.34±1.15），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.218，P=0.000）。進一步分析顯示，Oxa組細胞增殖活性低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而Ma+Oxa組細胞增殖活性低于Oxa組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 細胞凋亡情況

Oxa組與NC組細胞總凋亡率比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.012，P=0.049），Oxa組細胞總凋亡率高于NC組。Ma+Oxa組與Oxa組細胞總凋亡率比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.342，P=0.043），Ma+Oxa組細胞總凋亡率高于Oxa組。見圖2。

2.4 Ma對SW480/Oxa細胞P-gp、MDR1 mRNA表達的影響

研究發(fā)現(xiàn)，在Ma+Oxa組、PPARγ+Oxa組及PPARγ+Ma+Oxa組 3組 間 的 P-gp mRNA（F=14.315，P=0.000）以及 MDR1 mRNA（F=16.267，P=0.000）的相對表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。在Ma+Oxa組、SP600125+Oxa組以及SP600125+Ma+Oxa組3組間的P-gp mRNA（F=13.213，P=0.000）以及 MDR1 mRNA（F=15.221，P=0.000）的相對表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

表1 Ma對SW480/Oxa細胞P-gp、MDR1 mRNA表達的影響 （n =3，±s）

表1 Ma對SW480/Oxa細胞P-gp、MDR1 mRNA表達的影響 （n =3，±s）

注：1）與 Ma+Oxa組比較，P ＜0.05；2）與 PPARy+Ma+Oxa組比較，P ＜0.05；3）與 SP600125+Ma+Oxa組比較，P ＜0.05

組別 P-gp F值 P值 MDR1 F值 P值Ma+Oxa組 146.32±4.6 149.31±4.3 PPARγ+Oxa組 203.19±6.11）2） 14.315 0.000 210.45±5.81）2） 16.267 13.213 PPARγ+Ma+Oxa組 176.21±5.31） 172.54±4.91）Ma+Oxa組 146.32±4.6 149.31±4.3 SP600125+Oxa 組 134.21±3.41）3） 13.213 0.000 140.15±3.81）3） 15.221 13.213 SP600125+Ma+Oxa組 123.16±2.31） 131.15±3.11）

2.5 P-gp、p-JNK蛋白的表達水平

研究發(fā)現(xiàn)，在Ma+Oxa組、PPARγ+Oxa組以及PPARγ+Ma+Oxa組3組間的P-gp蛋白（F=12.315，P=0.000）以及p-JNK蛋白（F=15.267，P=0.000）的相對表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3和表2。在Ma+Oxa組、SP600125+Oxa組以及SP600125+Ma+Oxa組3組間的P-gp蛋白（F=13.213，P=0.000）以及p-JNK蛋白（F=15.221，P=0.000）的相對表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3和表2。

表2 Western blot檢測P-gp，p-JNK蛋白的相對表達水平 （n =3，±s）

表2 Western blot檢測P-gp，p-JNK蛋白的相對表達水平 （n =3，±s）

注：1）與Ma+Oxa組比較，P ＜0.05；2）與PPARγ+Ma+Oxa組比較，P ＜0.05；3）與SP600125+Ma+Oxa組比較，P ＜0.05

組別 P-gp F值 P值 p-JNK F值 P值Ma+Oxa組 0.489±0.052 0.221±0.031 PPARγ+Oxa組 0.867±0.0771）2） 12.315 0.000 0.434±0.0421）2） 15.267 0.000 PPARγ+Ma+Oxa組 0.576±0.0561） 0.284±0.0331）Ma+Oxa組 0.489±0.052 0.221±0.031 SP600125+Oxa組 0.369±0.0271）2） 13.213 0.000 0.246±0.0191）2） 15.221 0.000 SP600125+Ma+Oxa組 0.298±0.0241） 0.135±0.0131）

圖3 Western blot檢測P-gp，p-JNK蛋白的相對表達

3 討論

中藥苦參為豆科多年生落葉灌木植物苦參的干燥根。苦參性苦、寒，具清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效，用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、濕疹等?？鄥A是苦參中的抗癌有效成分，對肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和直腸癌等細胞均具有生長抑制作用。奧沙利鉑能夠通過作用于DNA形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)來抑制DNA的合成，產(chǎn)生抗腫瘤活性以及細胞毒作用[14]。由于因個體基因遺傳差異，結(jié)腸癌患者對于奧沙利鉑化療敏感性存在較大的差異，其中產(chǎn)生奧沙利鉑的耐藥性是導(dǎo)致患者化療失敗的主要原因。腫瘤細胞多藥耐藥（multi drug resistance, MDR）機制復(fù)雜，如MDR基因過多表達、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性降低或含量減少、谷胱甘肽解毒酶系統(tǒng)活性增高、MDR相關(guān)蛋白基因表達增高等。其中P-gp和LRP介導(dǎo)的MDR研究較多，是機制最為明確的MDR產(chǎn)生途徑。P-gp和LRP在細胞的表達水平與細胞耐藥程度呈正相關(guān)。最近已經(jīng)有多項研究表明苦參堿能夠抑制結(jié)腸癌細胞的生長。FOFARIA[15]研究發(fā)現(xiàn)，2.0 mg/ml苦參堿能夠抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的生長并且能夠抑制 COX-2的表達；NIU等[16]也觀察苦參堿能夠抑制結(jié)腸癌細胞SW116的增殖，并且抑制細胞端粒酶的活性；CHANG等[17]進一步深入研究發(fā)現(xiàn)苦參堿通過上調(diào)Bax的表達以及下調(diào)Bcl-2的表達來誘導(dǎo)HT-29細胞的調(diào)亡，從而起到抑制結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的作用。眾多研究表明[18-20]，JNK/SAPK信號通路與腫瘤細胞的化療耐藥性密切相關(guān)，本研究為了盡量減輕高濃度藥物引發(fā)的毒副作用，筆者選擇IC50前一濃度作為Ma濃度進行后續(xù)實驗，即選擇10 μmol/L作為后續(xù)實驗Ma的給藥濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ma可抑制其增值，促進其凋亡，Ma可降低P-gp，MDR1 mRNA表達，還可降低P-gp、p-JNK蛋白的表達，提示Ma具有調(diào)控人結(jié)腸癌耐藥細胞株耐藥性的作用，可能與抑制JNK/SAPK信號通路，降低P-pg表達有關(guān)。本研究結(jié)果提示，Ma對調(diào)控結(jié)腸癌化療耐藥性有一定效果，研究結(jié)果為應(yīng)用苦參堿干預(yù)結(jié)腸癌機制提供實驗依據(jù)，Ma有望成為改善結(jié)腸癌化療耐藥性的新藥物，但還需大量的基礎(chǔ)實驗和臨床實驗深入研究。

綜上所述，Ma具有調(diào)控人結(jié)腸癌耐藥細胞株耐藥性的作用，可能與抑制JNK/SAPK信號通路，降低P-pg表達有關(guān)。