圓窗途徑內(nèi)耳藥物載體的研究現(xiàn)狀

林壽凱 王軍義

廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

由于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)位于顳骨內(nèi)相對封閉，且與全身血液循環(huán)之間存在血-迷路屏障，因此經(jīng)全身給藥途徑進入內(nèi)耳的藥物劑量極為有限，此外經(jīng)全身給藥也可能對身體其他器官造成不良反應(yīng)，而內(nèi)耳的局部給藥相比全身給藥具有高效，副作用小的特點[1]，故內(nèi)耳局部給藥越來越受到關(guān)注。內(nèi)耳局部給藥主要分為有創(chuàng)給藥和微創(chuàng)給藥，而有創(chuàng)給藥可能對外耳道和中耳造成永久性損害，故微創(chuàng)給藥具有廣泛的研究價值和應(yīng)用前景，其中圓窗給藥途徑是微創(chuàng)治療方法的重要選項。圓窗是通過局部給藥治療內(nèi)耳病變最重要的界面，研究表明不僅小分子藥物能滲透通過圓窗膜進入耳蝸外淋巴液，微球粒徑為1μm時也能穿過圓窗膜進入內(nèi)耳，目前圓窗給藥方法尚處于實驗階段，在臨床應(yīng)用之前，要克服的最重要的問題之一是開發(fā)針對目標部位的藥物的智能送藥系統(tǒng)，并在內(nèi)耳中控制釋放[2]，實現(xiàn)上述目標的重要條件之一就是圓窗途徑藥物載體的研究和選擇。內(nèi)耳局部給藥的載體分為多種，包括病毒載體、納米粒載體、蛋白質(zhì)載體、原位凝膠等[2-4]?，F(xiàn)就內(nèi)耳藥物載體及圓窗途徑應(yīng)用的相關(guān)研究綜述如下。

1 病毒載體

病毒載體是利用病毒質(zhì)粒構(gòu)建目標基因的載體，可轉(zhuǎn)染至目標細胞實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因功能，是內(nèi)耳疾病基因治療研究的重要工具。病毒載體具有較好的靶向性和高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但同時病毒載體具有一定的局限性，如無法轉(zhuǎn)移大尺寸的基因，成本高等缺點[5]。常見的內(nèi)耳基因病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒載體。

1.1 腺病毒載體

腺病毒是一種大分子雙鏈無包膜DNA病毒，它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中；腺病毒載體是內(nèi)耳基因治療研究中最常用的病毒載體，基因容量為8000bp[6]，具有轉(zhuǎn)染效率高、低細胞毒性等特點，Shu[7]等發(fā)現(xiàn)腺病毒載體能夠有效地在哺乳動物內(nèi)耳中轉(zhuǎn)染不同的細胞類型，最常見的靶細胞是內(nèi)耳聽覺毛細胞和支持細胞，Staecker等[8]發(fā)現(xiàn)腺病毒載體能成功轉(zhuǎn)染包括聽覺毛細胞和前庭毛細胞在內(nèi)的眾多內(nèi)耳細胞，Suzuki的研究[9]也有類似的發(fā)現(xiàn)，可見腺病毒載體雖然在內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染效率高，但特異性不強；Luebke等[10]研究發(fā)現(xiàn)重組腺病毒載體能轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細胞和外毛細胞，且緩慢注入比快速注入更能提高對毛細胞轉(zhuǎn)染率；Staecker等[8]在其研究中還發(fā)現(xiàn)腺病毒載體對內(nèi)耳細胞的功能沒有明顯的損傷，表明腺病毒載體具有低細胞毒性；但腺病毒載體在進入內(nèi)耳的過程大多是有創(chuàng)的，常見的方法包括耳蝸造口術(shù)、圓窗穿刺給藥，雖然圓窗穿刺途徑比耳蝸造口術(shù)創(chuàng)傷小、易操作，但其對外耳的創(chuàng)傷依然是臨床應(yīng)用所不能接受的；早在2001年Jero等[11]發(fā)現(xiàn)明膠海綿可以在鼓室輔助腺病毒載體無創(chuàng)透過圓窗進入內(nèi)耳，但其操作依然對外耳道和中耳損傷嚴重。

1.2 腺相關(guān)病毒載體

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，作為載體其基因容量為4000-5000bp[6]，根據(jù)AAV病毒衣殼的差異已確定了12種血清型(AAV-1～AAV-12)[12]，不同血清型AAV載體對內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的靶細胞不同；在耳蝸內(nèi)毛細胞方面，AAV-1、2、4、5、6、7、8和9的載體主要轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細胞，還可轉(zhuǎn)染Hensen細胞[13,14]，而AAV-3的載體只被發(fā)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染耳蝸內(nèi)毛細胞，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染其他內(nèi)耳細胞[14]，其余類型的血清型（AAV-10、11、12）暫未發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛細胞的轉(zhuǎn)染研究；此外，部分血清型（AAV-1～AAV9）[13-15]和重組腺相關(guān)病毒可轉(zhuǎn)染外毛細胞，但外毛細胞轉(zhuǎn)染效率明顯低于內(nèi)毛細胞；目前利用AAV載體進入內(nèi)耳的給藥途徑有耳蝸造口術(shù)、圓窗穿刺和跨圓窗膜給藥三種方式，研究發(fā)現(xiàn)利用腺相關(guān)病毒載體跨圓窗膜給藥比耳蝸造口術(shù)、圓窗穿刺給藥更安全，降低了損傷的發(fā)生幾率，且跨圓窗膜給藥也具有較高的轉(zhuǎn)染效率，只是目前跨圓窗膜給藥方式依然需要通過外科方式暴露圓窗。

1.3 慢病毒載體

慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷I型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，屬于RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，基因容量為8000bp[6]，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體在內(nèi)耳的應(yīng)用研究[4,16]中表現(xiàn)出安全性好、轉(zhuǎn)染效率高、基因表達長期穩(wěn)定等特點，研究[4,17-19]發(fā)現(xiàn)慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)染大部分耳蝸細胞類型（包括內(nèi)毛細胞、外毛細胞、上皮細胞、支持細胞），并且發(fā)現(xiàn)慢病毒載體在內(nèi)耳轉(zhuǎn)染效率高，但特異性不強；Pietola L等[17]研究發(fā)現(xiàn)慢病毒引起的細胞炎癥反應(yīng)水平低，是一種安全的載體；目前慢病毒載體內(nèi)耳給藥途徑為耳蝸注射、跨圓窗膜給藥的方式；陳文博[20]利用慢病毒載體跨圓窗膜轉(zhuǎn)導(dǎo)白細胞介素-10（IL-10）進入內(nèi)耳，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體可在內(nèi)耳長期穩(wěn)定表達；慢病毒載體具有很好的應(yīng)用前景，但靶向性不強可能限制其使用范圍，而且它對外毛細胞的轉(zhuǎn)染率低[16,19]。

1.4 單純皰疹病毒載體

單純皰疹病毒型載體，主要由I型單純皰疹病毒（HSV-1）改造而來，基因容量為30000bp[6]，是雙鏈線性DNA病毒載體，但單純皰疹病毒持續(xù)表達時間較短，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低；目前，單純皰疹病毒載體在內(nèi)耳給藥方式主要是以耳蝸注射為主，利用重組單純皰疹病毒載體經(jīng)注射給藥進入耳蝸的研究中，主要轉(zhuǎn)染了成纖維細胞、間充質(zhì)細胞、上皮細胞、Hensen細胞、Deiters細胞[4]，研究發(fā)現(xiàn)重組單純皰疹病毒載體的細胞毒性較低，適合用作基因的長期載體；但是，Holt JR等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒不能轉(zhuǎn)染毛細胞；目前，有關(guān)內(nèi)耳的研究中未發(fā)現(xiàn)該載體跨圓窗膜滲透給藥方式。

1.5 牛痘病毒載體

牛痘病毒的基因組很大，該載體安全性好，基因容量為25000bp[6]，具有快速復(fù)制和分解受感染的細胞、獲得高水平的病毒基因表達能力、傳播細胞到細胞的能力，牛痘病毒具有廣泛的感染宿主，因而是一種非常有效的DNA重組載體，且活動不受缺氧和治療照射的影響[22]；Derby ML[4]等人利用耳蝸注射的方式將牛痘病毒載體轉(zhuǎn)移到豚鼠的耳蝸細胞中，得到減少毛細胞受到傷害的結(jié)果，并主要轉(zhuǎn)染了成纖維細胞、間充質(zhì)細胞、上皮細胞、間皮細胞，少量轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細胞和外毛細胞；牛痘病毒雖然已被應(yīng)用于內(nèi)耳研究中，但相關(guān)的研究報道比較少，不是內(nèi)耳研究的主要病毒載體。

綜上所述，病毒載體在內(nèi)耳研究中的應(yīng)用特點總結(jié)參考表1。

2 納米粒載體

納米粒是指粒徑在1～100 nm，藥物可以溶解、包裹于高分子材料中形成的載體，是一種納米級范疇的亞微粒藥物載體輸送系統(tǒng)，具有促進藥物的持續(xù)釋放、靶向運輸、增加被載藥物溶解度、改善藥物吸收等特點[23,24]，特別是納米?？梢詿o損滲透過圓窗進入內(nèi)耳[25,26]，是一類很有應(yīng)用價值的內(nèi)耳藥物載體；目前用于內(nèi)耳藥物研究的納米粒主要有脂質(zhì)體納米粒載體、聚乳酸/乙醇酸納米粒載體（PLGA）。

2.1 脂質(zhì)體納米粒載體

脂質(zhì)體納米粒系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體，粒徑分布于20-1000nm，可以與細胞膜融合而將藥物導(dǎo)入細胞內(nèi)，進入內(nèi)耳細胞后，脂質(zhì)體膜能夠自動降解，故對細胞沒有毒性，具有極大的應(yīng)用前景，脂質(zhì)體納米粒載體被認為是迄今為止最成功的細胞藥物載體系統(tǒng)[25]，Wareing等[27]1999年首次成功使用陽離子脂質(zhì)體作載體經(jīng)耳蝸注射將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入內(nèi)耳細胞，且研究未發(fā)現(xiàn)任何毒性或炎癥反應(yīng)，說明脂質(zhì)體可以作為內(nèi)耳給藥的安全載體，目前其作為內(nèi)耳藥物載體的研究比較多，研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體載體能將藥物成功轉(zhuǎn)運至Claudius細胞、外毛細胞、內(nèi)柱細胞、外柱細胞等內(nèi)耳細胞[28]；目前，利用脂質(zhì)體納米粒作載體給藥進入內(nèi)耳的途徑有鼓膜穿刺經(jīng)鼓室緩釋跨圓窗膜滲透給藥、耳蝸造口術(shù)和耳蝸穿刺給藥，鼓膜穿刺經(jīng)鼓室緩釋跨圓窗膜滲透給藥方法是將載藥納米粒通過鼓膜途徑注射至鼓室內(nèi)，納米粒由液相轉(zhuǎn)變成凝膠狀附著于圓窗外達到緩釋效應(yīng)，因此比耳蝸造口術(shù)和耳蝸穿刺創(chuàng)傷小、安全性高[25,28]。

2.2 聚乳酸/乙醇酸納米顆粒載體

聚乳酸/乙醇酸納米顆粒是一個帶電可生物降解乳酸和乙醇酸單體組成的共聚物，是聚合物納米顆粒，具有較高的穩(wěn)定性，較高的藥物運載量等優(yōu)點，但水溶性較差；Ge等[29]利用聚乳酸/乙醇酸納米粒載體跨圓窗膜將超順磁性氧化鐵導(dǎo)入內(nèi)耳的內(nèi)毛細胞、外毛細胞、支持細胞等內(nèi)耳細胞，說明聚乳酸/乙醇酸納米顆粒雖然轉(zhuǎn)運效率高，但特異性不強；但Wen等[30]通過化學(xué)修飾聚乳酸/乙醇酸納米粒表面的親水基團，提高載體的水溶性可以增加對外毛細胞的靶向性；目前，利用聚乳酸/乙醇酸納米顆粒作藥物載體進入內(nèi)耳途徑有耳蝸注射、跨圓窗膜滲透給藥，但研究發(fā)現(xiàn)跨圓窗膜給藥比注射給藥更高效[31]。

3 原位凝膠

原位凝膠是一種局部的藥物輸送系統(tǒng)，它具有良好的生物相容性和生物可降解性，原位凝膠在內(nèi)耳藥物運輸應(yīng)用廣泛，是一種特殊的內(nèi)耳藥物載體；利用原位凝膠將藥物經(jīng)鼓膜注射入中耳，在內(nèi)耳圓窗膜上形成儲層效應(yīng)，可有效控制藥物釋放進入內(nèi)耳的速度，達到緩釋效果[32,33]。陳鋼等[34]研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用泊洛沙姆407制備的原位凝膠在低于25℃時為液態(tài)，在32℃時變?yōu)榘牍虘B(tài)，該特點可被利用于保護對溫度敏感的藥物運輸；原位凝聚作為內(nèi)耳的藥物載體具有制備工藝簡單、毒副作用小、持續(xù)控制藥物釋放和微創(chuàng)等優(yōu)點[35]，但無法控制藥物進入內(nèi)耳后的生物行為，對內(nèi)耳細胞的靶向性差。

表1 耳蝸不同輸送病毒載體的特點比較Table 1 cochlear delivery of different viral vector comparison

4 蛋白質(zhì)載體

目前，利用蛋白質(zhì)作載體將藥物運送進入內(nèi)耳的相關(guān)研究極少，Qi等[36]利用破傷風(fēng)抗毒素（TAT）與雙鏈RNA結(jié)合域構(gòu)建了一種特殊的siRNA載體（TAT doublestranded RNA-binding domains，TAT-DRBDs），通過外科手術(shù)暴露圓窗，利用蛋白TAT-DRBDs結(jié)合siRNA成功跨圓窗膜滲透進入內(nèi)耳，并成功導(dǎo)入到內(nèi)毛細胞、外毛細胞等內(nèi)耳細胞，而且不具有細胞毒性，該研究為內(nèi)耳基因藥物載體實驗開拓了新的思路。

綜上所述，內(nèi)耳局部給藥系統(tǒng)構(gòu)建是解決內(nèi)耳疾病最具應(yīng)用前景的方式，該系統(tǒng)的構(gòu)建目前面臨的主要問題是創(chuàng)傷性，而圓窗膜的可滲透性為微創(chuàng)內(nèi)耳給藥系統(tǒng)的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)，如以固體脂質(zhì)體納米和原位凝膠為載體的內(nèi)耳藥物系統(tǒng)就可以通過鼓膜穿刺鼓室儲藥緩釋透過圓窗膜進入內(nèi)耳，達到微創(chuàng)的目的；病毒載體是內(nèi)耳疾病基因治療的重要工具，但目前尚無發(fā)現(xiàn)微創(chuàng)性的內(nèi)耳輸送方法，這也是需要研究的方向。