益氣固本膠囊調(diào)控哮喘小鼠核因子κB信號通路腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β含量的實驗研究

孔一卜， 孫麗平， 劉璐

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統(tǒng)常見的由多種炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)等共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道重塑是哮喘的主要病理改變，在其發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[1-3]，與哮喘反復(fù)發(fā)作密切相關(guān)。益氣固本膠囊是由國醫(yī)大師王烈教授驗方所研制，臨床效果顯著，可有效降低哮喘的發(fā)病率及復(fù)發(fā)病情[4-5]。前期相關(guān)實驗表明，本藥物可以調(diào)節(jié)免疫功能及白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)、γ干擾素(interferon-γ，INF-γ)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等哮喘病相關(guān)因子水平和蛋白表達(dá)[6-13]。更深入的研究在于對該病相關(guān)信號傳導(dǎo)通路中間匯聚點及下游信號調(diào)節(jié)作用的研究。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路被認(rèn)為是哮喘病的關(guān)鍵信號通路，參與哮喘氣道重塑的形成。相關(guān)研究表明哮喘發(fā)作與NF-κB被激活有關(guān)，炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)是NF-κB被活化過程中重要的刺激因子，其含量對于NF-κB的活性有一定的影響。因此本研究擬觀察益氣固本膠囊對哮喘模型小鼠血清、肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β含量的影響，探討益氣固本膠囊對NF-κB信號傳導(dǎo)通路活性的影響及推測其治療哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量18～20 g，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供[動物合格證號SCXK(吉)-2016-0008]。將60只BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：正常對照組(10只)、模型組(14只)、益氣固本膠囊組(12只)、童康片組(12只)、地塞米松片組(12只)。

1.2 試劑與藥品 益氣固本膠囊(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，批號：20160301)；童康片(廣州康和藥業(yè)有限公司，批號：160304)；醋酸地塞米松片(天津力生制藥股份有限公司，批號：1603014)；卵清白蛋白(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，Sigma分裝，純度>90%，Lot：080M1705V)。

1.3 研究方法 哮喘模型參照文獻(xiàn)[8]制備。給藥方法：根據(jù)臨床用量，折算成小鼠的等效計量為益氣固本膠囊1.1 g/kg、童康片0.88 g/kg、地塞米松片0.1 mg/kg。將上述藥物分別配置成益氣固本膠囊55 g/L、童康片44 g/L、地塞米松片0.005 g/L的藥液后，按20 mL/kg給予益氣固本膠囊組、童康片組、地塞米松組小鼠灌胃。正常對照組、模型組給予等容積的純凈水灌胃。連續(xù)給藥30 d，致敏期間藥物組繼續(xù)給予上述藥物，正常對照組、模型組給予等容積的純凈水。激發(fā)方法：參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行激發(fā)。每日激發(fā)1次，連續(xù)10 d，激發(fā)前1 h藥物組給予受試藥，正常對照組、模型組給予等容積的純凈水。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 一般情況 觀察小鼠在制備哮喘模型及給藥期間體表、呼吸頻率、體溫、體質(zhì)量的變化。

1.4.2 檢測指標(biāo) 摘小鼠眼球取血3 000 r/min離心10 min，取血清，置于-80 ℃低溫冰箱中保存。收取小鼠肺泡灌洗液3 000 r/min離心5 min，取上清液，置于-80 ℃低溫冰箱中保存。用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)測定血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較 制備哮喘模型后小鼠出現(xiàn)耳郭發(fā)紅，呼吸急促，體溫、體質(zhì)量明顯下降，根據(jù)體征進(jìn)行判斷，哮喘模型造模成功。經(jīng)益氣固本膠囊、童康片、地塞米松片治療后，上述癥狀明顯改善。

2.2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響 見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05。

表1結(jié)果表明，模型組小鼠血清中TNF-α與正常對照組比較含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。益氣固本膠囊組、童康片組、地塞米松組小鼠血清中TNF-α與模型組比較含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組小鼠血清中IL-1β含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影響 見表2。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表2結(jié)果表明，模型組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β與正常對照組比較含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。益氣固本膠囊組、童康片組、地塞米松組小鼠泡灌洗液中TNF-α、IL-1β與模型組比較含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為哮喘的反復(fù)發(fā)作與體內(nèi)肺脾腎三臟功能失調(diào)而導(dǎo)致的痰飲內(nèi)伏密切相關(guān)。伏痰留于體內(nèi)，每遇誘因引觸，氣引痰動，痰氣交阻于氣道而發(fā)為哮喘。明代張景岳在《景岳全書·喘促》中記載：“喘有宿根，遇寒即發(fā)，或遇勞即發(fā)者，亦名哮喘”；《證因治要》中寫道：“哮病之因，痰飲留伏，結(jié)成窠臼，潛伏于內(nèi)?！狈导仁且鸱磸?fù)發(fā)作的內(nèi)因，又是引起反復(fù)發(fā)作的宿根。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣道重塑是長期慢性炎癥作用于效應(yīng)細(xì)胞所致，表現(xiàn)為內(nèi)皮增生、基底膜增厚、平滑肌增生、基質(zhì)沉積、血管改變等，是哮喘的重要病理改變，也是影響哮喘療效的重要因素之一。相關(guān)研究表明，部分氣道重塑的病理改變早在4歲哮喘患兒就可發(fā)生。從哮喘的病因及產(chǎn)生機(jī)制來看，伏痰宿根與氣道重塑均是因長期病理因素導(dǎo)致機(jī)體功能失調(diào)所致，具有發(fā)作期“活化”和緩解期“潛伏”的共同特征[14]。因此，可以推測中醫(yī)理論的“伏痰宿根”與西醫(yī)哮喘的“氣道重塑”具有一定的相關(guān)性，在治療上均可通過調(diào)節(jié)肺脾腎三臟功能祛伏痰、除宿根，而達(dá)到抑制氣道重塑的目的。

益氣固本膠囊由黃芪、玉竹、補骨脂、女貞子、太子參、五味子、牡蠣、大棗、佛手、山藥、熟地等藥物組成，諸藥合用達(dá)到補肺氣以清痰窠，健脾胃以絕痰源，補腎元以充肺根，可以有效的調(diào)節(jié)肺脾腎三臟功能，祛除宿根，防病反復(fù)，達(dá)到治療的目的。由于我們推測伏痰宿根與氣道重塑的形成具有一定的相關(guān)性，而氣道重塑的形成與NF-κB信號通路活性增強(qiáng)有關(guān)，因此本實驗選取NF-κB信號通路中的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β作為研究對象做了相關(guān)實驗研究。實驗結(jié)果顯示，哮喘小鼠模型血清中TNF-α和肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β含量均高于正常小鼠，在經(jīng)益氣固本膠囊治療后呼吸急促等哮喘發(fā)作時的癥狀明顯的緩解，且血清中TNF-α和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量降低，說明益氣固本膠囊治療哮喘的作用機(jī)制可能和調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β含量有關(guān)。

NF-κB通路被認(rèn)為是哮喘病中關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該通路可以通過生長因子、細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等作用滲透于氣道重塑機(jī)制的多個環(huán)節(jié)和層面，參與氣道重塑的過程[15]。NF-κB信號通路活性的增強(qiáng)已經(jīng)在哮喘性過敏性實驗?zāi)Ｐ秃突颊咧凶C實。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通常與IκB形成復(fù)合體以無活性的方式存在于細(xì)胞漿中。TNF-α、IL-1β是對NF-κB活化響應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可以通過刺激氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，參與氣道重塑的形成。當(dāng)哮喘發(fā)作時，細(xì)胞受到外界炎癥刺激后，使得IκB被磷酸化，NF-κB由抑制狀態(tài)被激活，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的合成，增多的炎癥介質(zhì)作為外界刺激，進(jìn)一步增強(qiáng)NF-κB的活性[16]。

因此我們推測，小鼠在造成哮喘模型后出現(xiàn)TNF-α、IL-1β含量增多及呼吸急促等癥狀可能與NF-κB信號通路被激活有關(guān)，而經(jīng)益氣固本膠囊治療后TNF-α、IL-1β含量減少且呼吸急促等癥狀緩解，說明益氣固本膠囊可能通過調(diào)節(jié)哮喘小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-1β含量來抑制NF-κB信號通路活性從而發(fā)揮治療哮喘的作用。益氣固本膠囊可以去除宿根伏痰，而宿根伏痰與氣道重塑又有一定的相關(guān)性，氣道重塑的形成與NF-κB信號通路被激活有關(guān)，因此我們進(jìn)一步推測益氣固本膠囊治療哮喘的作用機(jī)制也可能和調(diào)節(jié)NF-κB信號通路活性從而抑制氣道重塑有關(guān)，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。