皂莢提取物對(duì)肝癌大鼠微血管密度及肝臟病理影響的實(shí)驗(yàn)研究*

阮連國(guó) 張定宇 洪 可 張 妍 張赤志

1.武漢市醫(yī)療救治中心中西醫(yī)結(jié)合肝病科 (湖北 武漢， 430023) 2.武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心 3.湖北省中醫(yī)院肝病科

原發(fā)性肝癌(PLC)是常見(jiàn)惡性腫瘤，在全球癌癥發(fā)病率中居第5位，死亡率居第3位[1]。其起病隱匿、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移、生存期短、預(yù)后很差，在我國(guó)為惡性腫瘤第2位死因[2]。中醫(yī)中藥作為惡性腫瘤綜合治療的重要組成部分，具有獨(dú)特療效。前期臨床研究證實(shí)皂莢治療肝癌具有一定療效[3],實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)皂莢提取物通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性、調(diào)節(jié)肝臟組織Smad4 mRNA和Smad7 mRNA的表達(dá) 、加強(qiáng)TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)的傳導(dǎo)、影響肝癌大鼠TIMP3/MMPs蛋白表達(dá)等抑制肝癌細(xì)胞增殖[4～9]。本實(shí)驗(yàn)研究皂莢提取物對(duì)肝癌大鼠微血管密度(MVD)及肝臟病理的影響，進(jìn)一步探討其抗肝癌作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 Walker-256 癌細(xì)胞株購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司。雄性Wistar斷奶大鼠6只，體重40～80g，供癌細(xì)胞增殖傳代使用；SD雄性大鼠60只，體重200g±20g，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，兩組動(dòng)物均購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 藥物 豬牙皂提取物正丁醇部位由湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院許漢林教授制作提供。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑 -20℃及-80℃冰箱、超凈工作臺(tái)、微量加樣器、恒溫水浴槽、酶標(biāo)儀、Eppendorf 管、玻璃吸管、低溫高速離心機(jī)、15ml 離心管、手術(shù)器械一套(血管鉗、三角針、有齒鑷、組織剪、手術(shù)刀、5～0 絲線、持針器)、消毒棉球、棉簽、注射器(1ml、5ml、10ml)。10%水合氯醛、PBS 緩沖液、0.9%氯化鈉溶液、0.5%活力碘、紅霉素軟膏。

1.4 動(dòng)物模型及分組 將Walker-256細(xì)胞株凍存管水浴融化，加入8ml PBS 緩沖液，以1000轉(zhuǎn)/分的速度離心10min，去上清液，用PBS 緩沖液清洗及重懸細(xì)胞，在5 只Wistar大鼠的腹腔內(nèi)分別注入1ml細(xì)胞懸液，1個(gè)月后觀察大鼠腹部逐漸膨起，癌性腹水形成，從傳代的 Wistar大鼠體內(nèi)抽取癌性腹水5ml，離心、棄上清液，取下層粘稠濃縮腹水1ml備用。

60只大鼠隨機(jī)挑選50只，分別使用水合氯醛麻醉、固定、消毒，行手術(shù)暴露大鼠肝臟，取最外層肝葉作為注射部位，將裝有癌性腹水的注射器斜刺入肝葉內(nèi)約 0.5cm，注入癌性腹水約0.05ml，快速拔出注射器針頭，止血、逐層關(guān)閉腹腔，傷口消毒，進(jìn)行一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分為5組，即皂莢提取物低劑量(0.15g/kg/d) 組(A)、皂莢提取物中劑量(0.3g/kg/d)組(B)、皂莢提取物高劑量(0.6g/kg/d)組(C)、索拉非尼(0.08g/kg/d)組(D)、模型(0.9%生理鹽水10 ml/kg/d)組(E)，對(duì)肝癌大鼠進(jìn)行灌胃。余下10只大鼠為空白對(duì)照組(F)：0.9%生理鹽水10 ml/kg/d對(duì)正常大鼠進(jìn)行灌胃。每天灌胃1次，每周連續(xù)灌胃6次，周日測(cè)大鼠體重，然后根據(jù)體重調(diào)整劑量，均連續(xù)給藥30天，脊椎脫臼法處死大鼠，空白組大鼠取肝臟組織，造模大鼠選取肝臟內(nèi)癌組織制作組織切片及留存。

1.5 MVD 的判斷標(biāo)準(zhǔn) 參照Weidner校正方法，先用低倍鏡(×10)在每一個(gè)標(biāo)本下選取熱點(diǎn)(5個(gè)微血管數(shù)最多的區(qū)域)，然后在每一個(gè)熱點(diǎn)中計(jì)算一個(gè)高倍鏡(×40)下的微血管數(shù)目，取其平均值為MVD值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝癌組織MVD表達(dá)情況 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝癌組織中MVD表達(dá)比較±s)

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01;與索拉菲尼組比較，△P>0.05

2.2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)改變 見(jiàn)插頁(yè)彩圖1，空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，胞漿胞核均勻，肝細(xì)胞索排列整齊，無(wú)纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)失常，肝小葉被腫瘤組織替代，肝血竇周?chē)梢?jiàn)纖維組織增生；匯管區(qū)增寬，腫瘤細(xì)胞呈圓形，再生活躍，異型性明顯，細(xì)胞核染色變深，核質(zhì)比變大，部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布。皂莢提取物低劑量組大鼠相對(duì)于模型組大鼠，肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，一部分肝小葉被腫瘤組織取代；核固縮現(xiàn)象明顯，核質(zhì)比很大，部分細(xì)胞呈團(tuán)塊狀；肝竇擴(kuò)張，肝血竇周?chē)欣w維組織增生。皂莢提取物中劑量組大鼠相對(duì)于模型組大鼠，肝小葉的結(jié)構(gòu)有一定的恢復(fù)，腫瘤組織、異型性細(xì)胞數(shù)量和過(guò)塑細(xì)胞數(shù)量減少，肝血竇周?chē)紶柨梢?jiàn)到纖維組織增生。皂莢提取物高劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整，細(xì)胞胞漿胞核均勻，大部分肝小葉細(xì)胞正常，部分細(xì)胞有核固縮和異型性的現(xiàn)象，相較于模型組大鼠，狀態(tài)改善很明顯；肝血竇周?chē)苌僖?jiàn)到纖維組織增生。索拉菲尼組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整，細(xì)胞胞漿胞核均勻，肝細(xì)胞索排列整齊，胞核較大，整體分布較均一；肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn), 基本沒(méi)有纖維組織增生。與正常組相比，有很少部分細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)異型性，無(wú)團(tuán)狀分布現(xiàn)象。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為依賴于新生血管的生成，腫瘤微血管密度(MVD)作為衡量腫瘤血管生成的一個(gè)重要指標(biāo)，與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著十分密切的關(guān)系[10]。肝癌是典型的多血管腫瘤，在其生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中離不開(kāi)腫瘤血管提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣，肝癌組織中微血管密度直接反映了血管生成情況[11]。因此，抗腫瘤血管生成已成為有效的抗腫瘤方法之一。

中醫(yī)認(rèn)為癌多為痰阻、氣滯、血淤、熱毒等相互博結(jié)而成，其中痰濁內(nèi)阻是腫塊最終形成的病機(jī)關(guān)鍵[12]。《丹溪心法》曰：“凡人身上、中、下有塊者，多是痰”；“痰挾瘀血，遂成窠囊”。同時(shí)痰瘀可以互化，痰可致瘀，瘀可生痰[13]。中醫(yī)古籍中，并無(wú)肝癌之病名，但有類(lèi)似肝癌癥狀、體征和成因的記載，如“巖”“積聚”“癥瘕”“脅痛”“鼓脹”“黃疸”“腹痛”等，病機(jī)有“正虛”“邪實(shí)”兩方面，《醫(yī)宗必讀·積聚》中說(shuō)：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之?！备伟┎C(jī)可歸納為三點(diǎn)：其一是肝氣失于條達(dá)，氣滯血瘀；其二為痰飲內(nèi)停，郁而化熱，濕熱蘊(yùn)結(jié)；其三為肝腎虧虛，脾胃內(nèi)傷，正氣虧虛。故痰瘀毒交結(jié)，正不勝邪，而發(fā)癌腫，久留難去，而成危重之疾。關(guān)于肝癌治療，《內(nèi)經(jīng)》中也載有“堅(jiān)者削之”“結(jié)者散之”的治療法則。秦漢時(shí)期《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載的皂莢、海藻、鱉甲、半枝蓮、黃芪等治療肝癌，迄今仍具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。皂莢味咸，性溫，有小毒，具有祛頑痰，除濕毒的作用。唐代《千金要方》卷十九用皂莢治“積聚徴?qǐng)?jiān)”等，是治療癌癥的常用中藥。香港理工大學(xué)與美國(guó)國(guó)立癌癥研究所研究發(fā)現(xiàn)，皂莢濃縮液具有抗癌的特性，可以有效抑制血癌及多種人類(lèi)實(shí)體腫瘤，包括乳腺癌、肝癌和前列腺癌等癌細(xì)胞生長(zhǎng)[14]。

本研究通過(guò)皂莢提取物對(duì)肝癌大鼠微血管密度(MVD)及肝臟病理的影響的觀察，發(fā)現(xiàn)肝癌大鼠組織MVD明顯增高，皂莢提取物可明顯降低大鼠MVD，改善肝臟病理，提示皂莢提取物可以有效防治肝癌，其作用機(jī)理與調(diào)節(jié)肝癌組織MVD密切相關(guān)，其分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。