siRNA靶向沉默ZFX基因對肝內膽管癌細胞生物學功能的影響

張 雪，劉國東，林 群，方 強，謝 坤，趙義軍，劉付寶

肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是一種起源于膽管上皮細胞的致命惡性腫瘤[1]。該腫瘤在美國每年的發(fā)病人數在1 300～3 000例之間[2]。慢性炎癥性病癥被認為是肝內膽管癌的誘因因素[3]。由于早期無明顯的癥狀、體檢尚未普及等原因致ICC明確診斷通常較晚，手術是目前最好的治療方式，術后5年生存率約20%～50%[4]。X染色體耦聯的鋅指蛋白(X-linked zinc finger protein,ZFX)位于X染色體，編碼krueppel C2H2型鋅指蛋白家族成員[5]。在胚胎細胞和成人造血干細胞具有重要的轉錄調解作用[6]。研究[7]證明ZFX的過表達與膽囊癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均有密不可分的關系。ZFX在肝內膽管癌中的作用尚不明確，目前國內外未見相關文獻報道。該實驗運用siRNA沉默肝內膽管癌細胞的ZFX的表達，觀察其對細胞生物學性質的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與siRNA核苷酸片段的合成 選取人膽管細胞型肝癌細胞株(cholangiocarcinoma cells,HCCC-9810)作為實驗對象，由上海交通大學新華醫(yī)院饋贈；siRNA由上海漢恒生物科技公司合成；siRNA序列:5′-GTCGGAAATTGATCCTTGTAA-3′；Scr-siRNA序列: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。使用前按說明書用DEPC水稀釋至需要濃度。

1.1.2主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；lipofectamine 3000試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；TRIzol裂解液購自美國Invitrogen公司；PCR反轉錄試劑盒購自上海Promega公司；兔抗人多克隆抗體、辣根過氧化物酶人抗兔IgG二抗購自美國Genetex公司；CCK-8增殖試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HCCC-9810細胞用含15%胎牛血清、100 U/ml青霉素鏈霉素抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞轉染 轉染前1 d調整細胞濃度至覆蓋率約60%,并用不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗分組分別為Cell組(未轉染siRNA的HCCC-9810細胞組)、NC-siRNA組(轉入negative control的細胞組)、ZFX-siRNA組(轉入ZFX的細胞組)。轉染方法嚴格按照lipofectamine 3000的操作說明進行，5 h后更換為RPMI-1640普通培養(yǎng)基。

1.2.3RT-PCR檢測各組轉染后ZFX的mRNA表達水平 轉染48 h后收集細胞，使用TRIzol(Invitrogen公司)試劑提取RNA，嚴格按照操作說明進行，檢測各組RNA總量，然后按照說明書使用反轉錄酶、Oligo dT(Promega)反轉錄為cDNA，進行RT-PCR反應，GAPDH作為內參，GAPDH引物序列為：正義鏈：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′; 反義鏈：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；ZFX 引物序列為：正義鏈 5′-GGCAGTCCACAGCAAGAAC-3′；反義鏈：5′-TTGGTATCCGAGAAAGTCAGAAG-3′，以2-ΔΔt計算各組ZFX基因mRNA的表達量，每組各實驗3次。

1.2.4Western blot檢測 將轉染后的各組細胞離心后，PBS洗滌3次，離心棄上清液，加入RIPA裂解液30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液。SDS-PAGE凝膠電泳轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，孵育兔抗人多克隆抗體(1 ∶1 000)搖床慢搖2 h，TBST慢搖清洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育2 h，于暗室滴加ECL，覆蓋X線片曝光，顯影，拍照，保存。

1.2.5克隆形成實驗 24孔板內培養(yǎng)HCCC-9810細胞，覆蓋率達70%后siRNA轉染，每組設置3個復孔，3 d后收集各組轉染成功的細胞，各組對應六孔板內鋪約400個細胞，充分搖勻并顯微鏡下觀察至無細胞聚集，每2 d更換細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)至2周后4%多聚甲醛固定15 min，Giemsa染色20 min，顯微鏡下隨機抽取5個視野，分別統(tǒng)計每孔內>50及<50個細胞的克隆細胞集落數并分析結果。

1.2.6CCK-8法檢測細胞增殖實驗 持續(xù)增殖能力是癌細胞最基本的能力。設置實驗組、空白對照組及陰性對照組，每組3個復孔，取對數生長期的細胞，分別接種于96孔板內，每孔加入2×104/100 μl培養(yǎng)基，轉染后每間隔24 h加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，酶標儀測定595 nm處各孔的吸收值。

1.2.7Transwell遷徙、轉移實驗 24孔板transwell chamber(0.8 μm，美國Cornning公司)，收集各組siRNA轉染后的細胞，上室內加入200 μl不含血清的細胞培養(yǎng)液，下室內加入600 μl含15%FBS的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中自然遷移條件下培養(yǎng)24 h后甲醛固定10 min，結晶紫染色10 min，棉簽拭去上室內細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察轉移至下室內的細胞并拍照、計數。轉移實驗需每室內加入37 ℃培養(yǎng)基200 μl 水化膠，培養(yǎng)48 h后固定染色，其他同遷徙實驗。

2 結果

2.1siRNA對HCCC-9810細胞ZFXmRNA表達水平的影響轉染48 h后，RT-PCR結果顯示：Cell組與NC-siRNA組之間mRNA表達水平未見明顯差異，ZFX-siRNA組mRNA表達水平與Cell組、siRNA-NC組相比下降明顯(P<0.01)，見圖1。

圖1 沉默ZFX基因對HCCC-9810細胞ZFX mRNA表達水平的影響

2.2siRNA轉染HCCC-9810細胞后ZFX蛋白的表達Western blot 檢測結果與RT-PCR結果相一致，Cell組與NC-siRNA組之間比較，ZFX基因表達水平未見明顯改變，ZFX-siRNA組蛋白表達水平與Cell組、NC-siRNA組相比下降明顯，RT-PCR和Western blot均證實ZFX-siRNA使HCCC-9810細胞的ZFX基因表達下調明顯。見圖2。

圖2 siRNA轉染HCCC-9810細胞后蛋白印跡圖

2.3沉默ZFX對膽管癌細胞克隆形成的影響結果顯示siRNA-ZFX實驗組的小克隆(<50)細胞集落明顯多于Cell組及NC-siRNA組。顯微鏡下觀察結果：Cell組、NC-siRNA組之間形成克隆數、克隆形成率未見明顯差異(圖3B)，ZFX-siRNA組與NC-siRNA組相比每個克隆所包含的細胞數目明顯減少(t=3.188，P=0.0333)，各組重復3次，有輕度差異，但無統(tǒng)計學意義。該實驗結果表明敲低ZFX對于肝內膽管癌細胞的克隆形成能力具有重要的影響。見圖3。

圖3 沉默ZFX對膽管癌細胞克隆形成的影響

A：每個孔內的克隆圖片；B：每個孔內的克隆數統(tǒng)計結果；與NC-siRNA組比較：*P<0.05

2.4CCK-8檢測結果ZFX-siRNA組細胞增殖能力明顯弱于NC-siRNA組(F=150.3,P<0.01)及Cell組(F=151.5,P<0.01)，且隨著時間推移差異逐漸變大(圖4)，Cell組與siRNA-NC組之間及各組組內之間差異無統(tǒng)計學意義。結果表明敲低ZFX表達對肝內膽管癌細胞的增殖能力具有重要的影響。

圖4 沉默ZFX基因對HCCC-9810細胞增殖能力的影響

2.5沉默ZFX對肝內膽管癌細胞遷徙、侵襲的影響通過siRNA下調HCCC-9810細胞中ZFX基因后，能夠顯著抑制細胞的遷移及侵襲能力(圖5)，siRNA-ZFX組與siRNA-NC(t=8.505P=0.001)組相比可見轉移到下室的細胞數明顯減少，而Cell組與siRNA-NC組之間差異無統(tǒng)計學意義。圖6顯示，siRNA-ZFX組與siRNA-NC(t=8.311，P=0.002)組相比可見轉移到下室的細胞數明顯減少，而Cell組及siRNA-NC組之間差異無統(tǒng)計學意義。

圖5 沉默ZFX基因對HCCC-9810細胞遷移的影響 結晶紫染色×40 與NC-siRNA組比較： **P<0.01

圖6 沉默ZFX 基因對HCCC-9810細胞轉移的影響 ×40 結晶紫染色

3 討論

近年來，惡性腫瘤成為威脅人類健康的重要原因之一，ICC是當今人類危害最大的惡性腫瘤之一，我國ICC發(fā)病率增值迅速，多數學者把研究重點放在該腫瘤的治療上，對于該腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的機制及重要影響的關注力度明顯不夠，不能從根本上解決ICC的治療問題。原發(fā)性肝癌分為肝細胞性肝癌、膽管細胞性肝癌和混合型肝癌，在原發(fā)性肝癌中，膽管細胞性肝癌的發(fā)生率僅次于肝細胞性肝癌[8]，目前有早期癥狀不明顯、早期診斷困難、惡性程度較高等特點，致膽管細胞癌明確診斷時常屬于晚期，且該腫瘤容易向周圍血管及組織浸潤，致外科手術切除困難，膽管細胞癌放療、化療敏感性較低[9]，因此對膽管細胞癌的發(fā)生、發(fā)展的機制研究成為目前目標之一。深入研究ICC發(fā)生的分子機制，尋求新的診斷及治療方法是提高ICC整體療效的關鍵。鋅指蛋白是指含有穩(wěn)定的短的能與Zn2+結合的自我折疊形成手指結構的一類蛋白質，鋅指蛋白可以特異的與靶結構結合從而發(fā)生特定的影響。近期，國內外相關研究[10-12]表明ZFX在鼻咽癌、神經膠質瘤等惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后具有密不可分的關系，同時，參與多種腫瘤細胞的增殖、轉移、凋亡等多個過程[13-15]，而國內外尚未見該蛋白在ICC中的生物學作用的報道。本文旨在探討ZFX在ICC細胞中的生物學功能。

惡性腫瘤的惡性程度與腫瘤細胞的增殖、轉移、克隆等能力具有密不可分的關系，而ICC具有很強的早期轉移力、侵襲力強及預后差等特點，因此對于與肝內膽管癌細胞的增殖、遷移、侵襲及克隆能力等有影響的基因的研究成為早期診斷及靶向治療的研究方向。siRNA干擾技術是將與目的基因同源的雙鏈RNA轉染入細胞中，使與其對應的mRNA降解，從而實現目的基因序列沉默[16]。本實驗通過對ZFX基因特異靶點的siRNA及一條陰性對照siRNA，通過lipofectamine 3000分別轉入相對應的實驗組HCCC-9810細胞系中，并通過RT-PCR、Western blot從mRNA、蛋白水平檢測ZFX基因的表達水平，并為后續(xù)實驗提供基礎。本研究通過CCK-8增殖實驗、Transwell遷移、侵襲及克隆形成實驗證明ZFX基因表達的敲低導致肝內膽管癌細胞的增殖、轉移、侵襲及克隆能力明顯下調，表明ZFX在HCCC-9810細胞系的生長、轉移等過程中扮演著促進的角色。

盡管研究證明ZFX沉默對肝內膽管癌細胞的生物學功能具有重要影響，但具體機制尚不清楚，相關研究[17]表明在非小細胞肺癌中，miR-144過表達與ZFX的沉默能夠顯著抑制細胞的增殖且能誘導細胞凋亡，進一步研究表明ZFX的表達水平可通過miR-144調節(jié)，同時，ZFX的異常表達顯著降低miR-144對腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制作用，表明干擾miR-144-ZFX通路或許對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響。Akt、ERK1/2作為ZFX調節(jié)細胞功能的重要通路，NSCLC[18]、 LSCC[19]、 乳腺癌[20]和胃癌[13]中均會降低Akt、ERK1/2磷酸化作用。目前，國內外尚未見關于ZFX基因在ICC患者細胞中表達水平的檢測、與腫瘤惡性程度及預后的關系及miR-144、Akt、ERK1/2在ZFX調節(jié)ICC的通路中扮演的角色的報道，為深入探索ZFX在臨床上的功能的作用及具體機制的研究進一步證明ZFX在ICC的發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論方向。

綜上，降低ZFX在ICC細胞中的表達抑制細胞的增殖、克隆形成、遷移及轉移能力，持續(xù)對于ZFX在肝內膽管癌中的具體分子機制的研究將有助于進一步了解ICC的發(fā)生、發(fā)展，為膽管細胞癌的早期診斷及分子靶向治療提供依據。