RGDC肽修飾的金納米粒子協(xié)同光熱療法殺傷胰腺癌細(xì)胞的研究

任 樂，陳 軍，楊席席，韋瑞玲，許 朝，余 躍

胰腺癌被認(rèn)為是最致命的惡性腫瘤，5年生存率不足5%[1]。由于其早期癥狀隱匿且不典型，大多數(shù)患者在初次被確診的時(shí)候已經(jīng)到了中晚期，失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)。臨床上大多采用藥物化療(如吉西他濱)、放射治療以及生物治療等方法。但由于副作用多、靶向性差等弱點(diǎn)限制了這些方法的應(yīng)用。光熱療法(photothermal therapy，PTT)在腫瘤治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。金納米粒子(gold nanoparticles，AuNPs)由于其獨(dú)特的性質(zhì)被認(rèn)為可以作為PTT 的理想材料[2]。研究[3]顯示精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)在動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性。也有研究[4]報(bào)道富含半胱氨酸(cysteine)的酸性蛋白可增加胰腺癌對(duì)吉西他濱化療敏感性。該研究旨在觀察精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(Arg-Gly-Asp-Cys，RGDC)修飾的AuNPs協(xié)同PTT殺傷人原位胰腺癌細(xì)胞BxPC-3的效果，為AuNPs體內(nèi)外抗胰腺癌提供新的方法參考。

1 材料與方法

1.1材料氯金酸、檸檬酸鈉購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RGDC購自美國MedChemExpress公司；人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；RPMI-1640購自美國Invitrogen公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司；鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein，AM)和溴乙非啶豪莫二聚體(ethidium homodimer-1)購自美國賽默飛世爾公司 。

1.2方法

1.2.1RGDC肽修飾的AuNPs(RGDC/AuNPs)制備 取50 ml 1 mmol/L的氯金酸在劇烈攪拌(1 000 r/min)條件下煮沸。隨后迅速加入5 ml，38.8 mmol/L的檸檬酸鈉，待顏色由淺黃變成紫紅色，繼續(xù)煮沸10 min，AuNPs制備完畢，冷卻待用。取400 μl的上述AuNPs和400 μl RGDC(1 mmol/L)分散在5 ml的超純水中，置于28 ℃的水浴鍋中過夜，隨后用超純水6 000 r/min離心5 min去除多余的RGDC(重復(fù)3次)，RGDC/AuNPs粒子制備完畢。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI-1640 培養(yǎng)液(含有10% PBS和1%的雙抗)，將BxPC-3細(xì)胞置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，貼壁達(dá)到80%～90%時(shí)，利用0.25%的胰酶消化傳代。

1.2.3電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)檢測RGDC肽修飾前后的金納米粒子被細(xì)胞攝取的情況 待BxPC-3細(xì)胞孵育至對(duì)數(shù)期，用胰酶消化吹打重懸，種24孔板，每孔5×106個(gè)放置溫箱培養(yǎng)24 h，用RPMI-1640培養(yǎng)液分別配置AuNPs粒子和RGDC/AuNPs粒子，濃度分別為5、10、20 μg/ml，將不做任何處理的細(xì)胞孔作為空白對(duì)照，將上述溶液分別加入孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃溫箱中孵育24 h。之后吸出上清液，棄去含AuNPs 的培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，胰酶消化并計(jì)算細(xì)胞密度；1 500 r/min離心10 min；超聲裂解細(xì)胞，高速離心20 min；吸出上清液，烘干，用王水溶解、超純水定容，用 ICP-MS 測量AuNPs 含量。用測得的AuNPs含量除以總的細(xì)胞數(shù)量得到平均細(xì)胞攝取量。

1.2.4MTT法檢測光照后各組對(duì)細(xì)胞的殺傷作用 收集對(duì)數(shù)期BxPC-3細(xì)胞，置37 ℃、5% CO2溫箱孵育24 h，每孔加入10 μl不同納米粒子組溶液，濃度分別為5、10、20 μg/ml，同時(shí)設(shè)置不含納米粒子的對(duì)照孔，每組設(shè)定3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。洗掉孔板中培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液。分別用波長532 nm的光0.5 W/cm2的功率照射各組細(xì)胞5 min，在一次照射停止后，直至分散液的溫度恢復(fù)到室溫之后再重復(fù)照射，累計(jì)3次。光照結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入配好的MTT(1 mg/ml)，繼續(xù)溫箱培養(yǎng)4 h，加入20% 十二烷基硫酸鈉裂解液 (sodium dodecyl sulfate，SDS)，高速震蕩10 min，再用酶標(biāo)儀(570 nm波長)檢測各孔吸光度(optical density，OD)值。以如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。

1.2.5活死細(xì)胞染色法檢測光照后各組對(duì)細(xì)胞的殺傷作用 進(jìn)一步通過活死細(xì)胞染色直觀地觀察這種低功率光強(qiáng)下的MTT殺傷胰腺癌細(xì)胞的效果，種板方法同MTT檢測，培養(yǎng)24 h后洗凈原有培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分為3組，即不加AuNPs的空白對(duì)照組、10 μg/ml AuNPs組和10 μg/ml RGDC/AuNPs組，分別用波長532 nm的近紅外光0.5 W/cm2的功率照射三組細(xì)胞5 min，繼續(xù)放入溫箱培養(yǎng)8 h，隨后加入用PBS配置好的活死細(xì)胞染色液鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein，AM)2 μm/ml和溴乙非啶豪莫二聚體(ethidium homodimer-1,4 μm/ml)，每孔100 μl，室溫下孵育30 min，熒光顯微鏡拍照保存，最后用Image J統(tǒng)計(jì)各張圖片中的死細(xì)胞及活細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1納米粒子的成功制備電鏡視野下可觀察到數(shù)個(gè)致密的球形形貌，平均粒徑在45 nm左右。見圖1。 RGDC/AuNPs粒子及單純AuNPs粒子的紫外吸收峰值，RGDC/AuNPs粒子和AuNPs粒子吸收曲線存在明顯不同，提示了RGDC/AuNPs粒子制備成功。見圖2。

圖1 透射電鏡檢測AuNPs粒子的顆粒大小及形貌

圖2 RGDC四肽修飾前后AuNPs粒子紫外吸收變化

2.2細(xì)胞對(duì)RGDC修飾前后的金納米粒子的攝取情況兩組金納米粒子(AuNPs組和RGDC/AuNPs組)分別在2.5、5、10、20 μg/ml的濃度下與BxPC-3細(xì)胞孵育24 h，隨后利用ICP-MS檢測細(xì)胞對(duì)不同濃度條件下兩組納米粒子的攝取含量。隨著濃度梯度的增加，BxPC-3細(xì)胞對(duì)兩組納米粒子的攝取含量呈增長趨勢。在不同濃度梯度下，RGDC/AuNPs組的攝取量均多于AuNPs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.3光照前后各組對(duì)細(xì)胞的殺傷作用在未進(jìn)行光照的情況下，各組中BxPC-3細(xì)胞的細(xì)胞存活率都

在80%以上，且組間存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3A。進(jìn)一步采用波長為532 nm，功率密度為0.5 mW/cm2的激光照射兩組細(xì)胞5 min，照射停止后，待分散液的溫度恢復(fù)到室溫之后再重復(fù)照射，累計(jì)3次，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后檢測了各組的細(xì)胞數(shù)量。在3個(gè)不同濃度梯度下，RGDC/AuNPs組對(duì)胰腺癌細(xì)胞BxPC-3殺傷效果明顯強(qiáng)于AuNPs組(P<0.01)，表明RGDC/AuNPs粒子可能通過光熱協(xié)同效應(yīng)來抑制胰腺癌細(xì)胞BxPC-3，見圖3B、表2。

表1 不同濃度的兩組納米粒子和胰腺癌細(xì)胞共同培養(yǎng)后對(duì)兩組納米粒子攝取的量的比較

2.4熱療法對(duì)各組細(xì)胞抑制的情況通過活死細(xì)胞染色進(jìn)一步直觀地觀察光熱療法抑制細(xì)胞增長的效果。在活死細(xì)胞染色中，活細(xì)胞被標(biāo)記為綠色，死細(xì)胞被標(biāo)記為紅色。選取激光波長為532 nm，功率密度為0.5 W/cm2，經(jīng)過照射后發(fā)現(xiàn)未加入AuNPs的空白對(duì)照組基本無紅色標(biāo)記的死細(xì)胞出現(xiàn)，見圖4A；10 μg/ml AuNPs組有少量死細(xì)胞，見圖4B；而10 μg/ml RGDC/AuNPs組則從出現(xiàn)大面積的死細(xì)胞，見圖4C。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示RGDC/AuNPs組對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯高于AuNPs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表2 光照下各組納米粒子對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長抑制率的影響

表3 活死細(xì)胞染色法檢測各組對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長抑制率的影響

與AuNPs組比較：**P<0.01

3 討論

AuNPs具有獨(dú)特的表面等離子體共振的特性及光熱轉(zhuǎn)換效率顯著，在PTT抗腫瘤上被越來越多地研究[5]。由于AuNPs通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞較難，細(xì)胞攝取率較低，限制了其臨床應(yīng)用。如何通過對(duì)納米粒子的表面修飾增加對(duì)特定腫瘤細(xì)胞的靶向性，從而更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞仍然是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。

整合素被認(rèn)為在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，而RGD序列被認(rèn)為是絕大多數(shù)整合素的特異性配體，可控制及介導(dǎo)細(xì)胞在生物材料上的粘附行為[6]。Han et al[7]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)RGD肽一級(jí)序列后引入新的氨基酸可改變其對(duì)不同組織的親和性。前期研究[8]顯示胰腺癌細(xì)胞及其周圍的基質(zhì)分泌大量的已知的具有與紫杉醇療效相關(guān)性的蛋白質(zhì)，富含半胱氨酸。并且，該富含半胱氨酸的蛋白是一種分泌性細(xì)胞基質(zhì)糖蛋白，是一個(gè)潛在的細(xì)胞周期抑制因子，在接近70%的胰腺癌患者中存在表達(dá)[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)從如何對(duì)納米粒子表面功能化，開發(fā)出針對(duì)性的增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取等方面出發(fā)，制備了RGDC/AuNPs納米粒子。由于通過金巰鍵和AuNPs之間的共價(jià)連接形成較強(qiáng)的耦合，納米粒子的表面等離子體共振峰向近紅外區(qū)域移動(dòng)，從而使這種納米平臺(tái)可被有效的用于PTT中[10]。

圖3 MTT法檢測各組粒子光照或非光照對(duì)胰腺癌細(xì)胞BxPC-3細(xì)胞的殺傷作用

A：未光照的兩組粒子對(duì)胰腺癌細(xì)胞BxPC-3細(xì)胞孵育6 h的毒性；B： 光照6 h后兩組粒子對(duì)胰腺癌細(xì)胞BxPC-3細(xì)胞的殺傷作用；與AuNPs組比較：**P<0.01

圖4 活死細(xì)胞染色法檢測各組之間光照后對(duì)細(xì)胞的殺傷效果 ×200

圖5 AuNPs和RGDC/AuNPs在光熱條件下殺傷胰腺癌細(xì)胞的效果圖

進(jìn)一步觀察RGDC/AuNPs較普通AuNPs的優(yōu)勢，ICP-MS定量檢測直接證實(shí)了RGDC肽修飾的AuNPs被胰腺癌細(xì)胞攝取率顯著提高，接近單純金納米粒子的2倍，其中的原因可能歸結(jié)于RGDC肽對(duì)胰腺癌有主動(dòng)的靶向性。另外，經(jīng)過PTT照射后，RGDC/AuNPs顆粒能夠顯著增加光熱效率，原因可能是經(jīng)光照射后，巰金鍵斷裂，更多的AuNPs和RGDC游離在細(xì)胞內(nèi)，提高對(duì)細(xì)胞的損傷作用[11]。由于金巰鍵通常較為穩(wěn)定，既可以減少納米粒子的非靶向釋放，同時(shí)這種化學(xué)鍵可與硫醇反應(yīng)和(或)發(fā)生熱裂[12]。Piao et al[13]通過將金納米籠與細(xì)胞膜抗菌肽組成的協(xié)作納米系統(tǒng)作為光熱抗癌劑，在近紅外光照射下，該納米系統(tǒng)所產(chǎn)生的有效光熱殺傷了癌細(xì)胞，這可能是由于通過由金納米籠的光熱啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的硫醇反應(yīng)使得金巰鍵斷裂進(jìn)而釋放抗菌肽，進(jìn)一步起到膜損傷的作用。同時(shí)有研究[14]發(fā)現(xiàn)RGDC修飾的二氧化鈦 (titanium dioxide, TiO2)在紫外輻射下對(duì)海拉細(xì)胞(HeLa)具有更高的殺傷效果。本研究結(jié)果顯示RGDC/AuNPs組對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯高于AuNPs，這可能歸因于RGDC四肽本身對(duì)胰腺癌細(xì)胞表面整合素的靶向性以及RGDC四肽富含半胱氨酸，其對(duì)AuNPs殺傷胰腺癌細(xì)胞也具有一定的協(xié)同作用。具體的模擬圖見圖5。

綜上所述， 通過引入帶有巰基的半胱氨酸形成RGDC的四肽，使得半胱氨酸引入的巰基直接通過金巰鍵修飾到RGDC/AuNPs表面，由于這種RGDC四肽修飾后的納米粒子具有對(duì)胰腺癌細(xì)胞的靶向性，增加了胰腺癌細(xì)胞對(duì)這種納米粒子的攝取率， 同時(shí)實(shí)現(xiàn)了RGDC/AuNPs在熱響應(yīng)性情況下可發(fā)生巰基斷裂從而釋放RGDC四肽，增加了胰腺癌細(xì)胞內(nèi)富含半胱氨酸的RGDC四肽的游離濃度，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱化療敏感性，進(jìn)一步達(dá)到在光熱治療時(shí)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用，為AuNPs體外抗胰腺癌提供新的方法參考。但RGDC/AuNPs在體內(nèi)應(yīng)用效果有待進(jìn)一步研究。