基于超高效液相色譜-高分辨質譜技術的水中112種藥品和個人護理用品的高通量篩查和定量方法

陳 溪， 吳 慈， 王龍祥， 王 悅，寧興爽， 許傳鵬， 李 旺， 褚瑩倩

(1．中華人民共和國大窯灣海關，遼寧大連116600;2．中華人民共和國莊河海關，遼寧莊河116400)

作為一種“新興的環(huán)境污染物”，藥品和個人護理用品(pharmaceutical and personal care products，PPCPs) 越來越引起人們的廣泛關注［1］。PPCPs來源廣泛，包括各種處方藥、非處方藥、化妝品及洗化用品等，通常被稱為“偽持續(xù)性”污染物［2］。PPCPs主要通過污水處理廠排水進入環(huán)境中，進而通過飲用水進入人體，成為人體暴露于PPCPs最直接最主要的途徑之一［3］，且被證明可能對生態(tài)環(huán)境和人類健康存在一定的風險［4］。

PPCPs 已經(jīng)在世界范圍內如美國［5，6］、意大利［7］、非洲［8］、伊朗［9］、中國［1，10－14］等的水環(huán)境中被檢出，其檢出水平從 ng/L至 μg/L。Monteiro等［15］分析了地表水及飲用水樣品中的46個分析物，包括β-內酰胺、頭孢菌素、大環(huán)內酯類和氟喹諾酮類4類抗生素;樣品經(jīng)過膜預處理后，酸化并經(jīng)HLB柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UHPLC-MS/MS)分析，該方法地表水的定量限為3～38 ng/L，飲用水的定量限為 0.5至 64 ng/L。Wang等［16］將樣品酸化并經(jīng)HLB柱凈化，通過同位素稀釋-二維高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質譜聯(lián)用技術(UHPLC-Q/TOF MS)測量了飲用水中21種常見抗生素(5種大環(huán)內酯類、2種β-內酰胺類、3種四環(huán)素類、4種氟喹諾酮類、4種磺胺類和3種苯酚類)。在自來水中檢出氟苯尼考和甲砜霉素，其中值質量濃度分別為8.9 ng/L和6.4 ng/L;在個別瓶裝水樣品中檢出氟苯尼考，質量濃度范圍為1～6 ng/L。王軍淋等［17］將樣品酸化并經(jīng) HLB凈化，采用超高效液相色譜-三重四極桿飛行時間質譜(UHPLC-Q-TOF-MS)進行分析，水源水和自來水中磺胺類、β-內酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類共計40種抗生素定量限范圍為3～10 ng/L。Mallet等［18］則將樣品經(jīng)過Oasis MAX和Oasis MCX SPE的串聯(lián)小柱凈化，經(jīng)LC-MS/MS分析，實現(xiàn)了水樣中58種PPCPs的篩查和定量分析。綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，PPCPs在生活飲用水中的存在已是不爭的事實，然而其種類繁雜，包括抗生素、止痛藥、消炎藥、降壓藥、避孕藥、殺菌劑等，且含量很低，現(xiàn)有樣品前處理技術針對各種PPCPs的凈化能力有限，導致水樣中PPCPs的篩查范圍及定量準確性受到限制。本論文主要針對現(xiàn)有水中PPCPs類污染物檢測技術和方法存在的分析通量低、方法回收率低、靈敏度低的難題，基于高效液相色譜-高分辨質譜聯(lián)用技術(QExactive plus)高準確度、高通量的優(yōu)勢，建立了水中112種PPCPs的快速篩查數(shù)據(jù)庫及定量分析方法，并將其用于來自大連市7個區(qū)的水樣中PPCPs的篩查及定量分析。該高通量快速篩查定量檢測技術，可為水源地水質安全檢測篩查提供新方法、新技術，為水質安全監(jiān)測、預警和執(zhí)法提供必要的技術支持。

1 實驗部分

1．1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(Q-Exactive plus，Thermo Scientific，USA)，配可加熱的電噴霧離子源(HESI);固相萃取裝置(Supelco-24，USA);氮吹儀(Organomation NEVAP 112，USA)。

甲醇(HPLC級，德國 Merck公司);甲酸(HPLC級，上海安譜科學儀器有限公司);乙二胺四乙酸·二水合物(C10H14N2Na2O8·2H2O，純度99.999%，Macklin);濃鹽酸(優(yōu)級純，質量分數(shù)36%～38%，天津市化學試劑三廠);氨水(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);過濾膜(0.45 μm，美國安捷倫公司);大體積柱管及連接轉換頭(25 mL，天津艾杰爾科技有限公司);Cleanert PEP-2(60 mg/3 mL，艾杰爾);高純水經(jīng)Milli-Q超純水器純化得到;112種PPCPs類標準品包括磺胺類抗菌藥(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶等20種)，β-內酰胺類抗生素(頭孢匹林、頭孢他美酯、頭孢噻肟等6種)，喹諾酮類抗菌藥(西諾沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星等18種)，激素類抗炎藥(甲基睪丸酮、勃地酮、睪酮等18種)，大環(huán)內酯類(克林霉素、依普菌素、林可霉素等6種)，硝基咪唑類(阿苯達唑、二甲硝咪唑、甲硝唑等6種)，氨基甲酸酯類(異丙威、抗蚜威、殘殺威等7種)，四環(huán)素類(土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素4種)，β-受體阻斷劑類(納多洛爾、噴布洛兒、普萘洛爾3種)，糖尿病類(格列吡嗪、瑞格列奈、甲苯磺丁脲3種)，哮喘鎮(zhèn)咳類(西馬特羅、萊克多巴胺、克侖特羅等5種)，解熱鎮(zhèn)痛類(吲哚美辛、托麥汀、酮基布洛芬等6種)，抗炎類(茚酮苯丙酸、甲滅酸、美洛昔康等4種)，殺蟲、殺螨、殺菌劑類(啶蟲脒、啶酰菌胺、吡蟲啉等6種)(見表1)，其純度均大于98.3%，分別購自Sigma、Dr．Ehrenstorfer、First Standard 及 TRC 公司。

1．2 標準溶液的配制

112種PPCPs標準品用甲醇配制為質量濃度100 mg/L的儲備液，再各取1 mL，用甲醇定容至100 mL，并配制混合標準工作溶液1 mg/L，放置在－18℃的冰箱中保存。取混合標準工作液0.5 mL用5%(v/v)的甲醇水溶液定容至5 mL容量瓶中，即得到100 μg/L的溶液。再根據(jù)需要用5%(v/v)的甲醇水溶液將工作液逐級稀釋為100、80、50、40、25、20、10、5、2、1、0.1 μg/L，作為標準工作曲線溶液。

1．3 樣品制備

酸提:向50 mL水樣中加入15 μL濃鹽酸，使其pH值為3，然后加入25 mg乙二胺四乙酸·二水合物，振蕩溶解。

堿提:向50 mL水樣中加入150 μL氨水，使其pH值為10，然后加入25 mg乙二胺四乙酸·二水合物，振蕩溶解。

1．4 樣品凈化

采用聚乙烯二乙烯苯固相萃取(SPE)柱對所制備的樣品進行凈化。活化:用3 mL甲醇活化SPE柱;平衡:加入3 mL超純水(對酸性條件下提取的樣品，調超純水pH=3;對堿性條件下提取的樣品，調超純水pH=10)，在重力作用下自然滴下，保留約1 mL的水在SPE柱中;上樣:將25 mL大體積柱管用轉接頭連接于SPE柱上方，將制備的50 mL水樣轉移至管中，在真空泵的作用下，以8～10 mL/min的速度上樣，上樣結束后將SPE柱中的液體抽干;淋洗:在真空泵的作用下，用3 mL超純水(pH=7)淋洗兩次，然后將SPE柱中的液體抽干;洗脫:在重力作用下，用1 mL甲醇-乙腈(1∶1，v/v)洗脫3次，合并洗脫液，于40℃下氮氣吹干，用1 mL 20%(v/v)的甲醇水溶液復溶，上機測定。

1．5 色譜條件

色譜柱:Accucore RP-MS(100 mm×2.1 mm，2.6 μm，Thermo Scientific);柱溫:40 ℃;流動相A:0.1%(v/v)的甲酸水溶液;流動相B:0.1%(v/v)的甲酸甲醇溶液;流速:0.3 mL/min;進樣量:10 μL;分離梯度:5%B(0 min)－5%B(2 min)－30%B(7 min)－90%B(11 min)－90%B(13 min)－5%B(16 min)。

1．6 質譜分析條件

掃描模式:正離子模式;毛細管溫度:320℃;加熱溫度:320℃;鞘氣:N2，流速40 arb;輔助氣:N2，流速10 arb;噴霧電壓為(spray voltage):3 200 V;透鏡電壓:50 V;掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描(Full MS/dd-MS2)，一級質譜參數(shù)設置:全掃描分辨率70 000，自動增益控制目標(AGC target)1×106，最大駐留時間(maximum IT)100 ms，掃描范圍m/z 100～1 000;二級質譜參數(shù)設置:分辨率17 500，AGC target 2×105，最大駐留時間 50 ms。

1．7 數(shù)據(jù)處理

若只對水樣中的PPCPs進行定性篩查分析，取等體積的酸、堿提取溶液混合，進行LC-MS/MS分析。所采集的數(shù)據(jù)采用Trace Finder 3.3軟件進行分析，具體篩查條件設置如下:針對一級母離子精確相對分子質量設定的參數(shù)為:(1)響應強度閾值:10 000;(2)信噪比:5.0;(3)質量允許偏差:5×10－6。針對保留時間設定的參數(shù)為:允許時間偏移為30 s。針對二級碎片離子設定的參數(shù)為:(1)最少匹配數(shù)設置為1個;(2)響應強度閾值:10 000;(3)質量允許偏差:5×10－6。

如需針對水樣中的PPCPs進行定量分析，則需將酸、堿提取溶液分別進樣檢測，基于目標分析物的一級母離子峰面積，采用外標法進行定量，并采用Trace Finder 3.3軟件進行分析。

2 結果與討論

2．1 水質樣品提取條件的選擇

本實驗考察了酸提取和堿提取對樣品中112種PPCPs化合物的提取效果。在水樣中添加112種PPCPs化合物標準品(加標水平為0.2 μg/L)，分別進行酸提取及堿提取，然后經(jīng)SPE柱凈化濃縮，LC-MS/MS分析，計算所得回收率。結果顯示，33種PPCPs化合物適用酸提取，41種PPCPs化合物適合堿提取，其他38種化合物堿提、酸提均可，如頭孢類適合于酸提取，沙星類、磺胺類、硝基咪唑類大多適合于堿性提取。因此，針對水樣中不同種類PPCPs化合物的分析，應選擇適當?shù)奶崛》椒ǎ驹囼炞罱K確定的提取方式見表2。

2．2 LC-MS/MS 條件的優(yōu)化

2．2．1 色譜柱的穩(wěn)定性

本實驗考察了所采用的C18色譜分離柱在使用6個月過程中目標分析物的保留時間，以分析其穩(wěn)定性。以具有代表性的14種PPCPs化合物為例，其保留時間的RSD值均小于0.80%，說明此柱具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，適用于篩查分析。

2．2．2 質譜條件的選擇

本實驗采用高分辨質譜的Full MS/dd-MS2模式，為了得到分析物的最高儀器響應值，對質譜參數(shù)進行了優(yōu)化。在全掃描模式中，質譜分辨率對靶標物質的選擇性和靈敏度至關重要。當分辨率增大時，質譜能夠準確提取分析物的準確分子質量，使靈敏度提高;反之，當分辨率降低時，可能提取出與靶標物質具有相同碎片的干擾物，導致出現(xiàn)假陽性結果。但分辨率增高時，質譜掃描速率下降，導致色譜峰形變差，影響定量結果的準確性。因此需要基于所分析物質的色譜峰形，選擇最佳分辨率。多次實驗后，我們將一級質譜的掃描分辨率設為70 000，二級質譜分辨率設為17 500，所得112種PPCPs的提取色譜圖如圖1所示，可見其分辨率和分離度較好。

圖1 112種PPCPs化合物的提取離子色譜圖(20 μg/L)Fig．1 Extracted ion chromatograms(EIC)of 112 pharmaceutical and personal care products(PPCPs)(20 μg/L)

2．3 篩查數(shù)據(jù)庫的建立及驗證

本研究充分利用Q-Exactive高分辨質譜的優(yōu)勢，對112種PPCPs化合物采用Full MS/dd-MS2模式進行分析，獲得目標物的保留時間、母離子、碎片離子精確質量數(shù)及離子化形式等信息。然后采用Xcalibur軟件對112種化合物進行模擬碎裂，以各化合物二級質譜圖中實際碎片離子質量數(shù)與理論精確質量數(shù)偏差小于5×10－6，且豐度在前五強的離子作為特征碎片離子。最后以112種PPCPs化合物的保留時間、母離子理論精確質量數(shù)和特征二級碎片離子的理論精確質量數(shù)，建立篩查數(shù)據(jù)庫(見表1)，用于水中PPCPs的篩查。

表1 112種PPCPs的篩查數(shù)據(jù)庫Table 1 Screening database for the 112 PPCPs

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

為了驗證此篩查方法的可靠性，在添加水平為0.2 μg/L時，107種 PPCPs化合物均被“Confirmed”(確證出)，1種 PPCPs化合物顯示“Not Found”(未檢出)，4種PPCPs化合物顯示“Identified”(識別出，但存疑)，其確證率達到95.5%;樣品添加水平為0.4 μg/L時，109種PPCPs化合物均被“Confirmed”，3種 PPCPs化合物顯示“Identified”可疑，其確證率達到97.3%;樣品添加水平為0.8 μg/L時，111種 PPCPs化合物均被“Confirmed”，1種PPCPs化合物顯示“Identified”可疑，其確證率達到99.1%。

2．4 方法的線性關系、定量限和回收率

以目標物母離子的提取色譜峰面積為縱坐標y，以目標物的質量濃度為橫坐標x，繪制標準曲線。所有PPCPs化合物在一定的濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(r2)均大于0.99(見表2)。在空白蒸餾水中添加低濃度的目標化合物，經(jīng)過樣品提取及凈化，進樣分析，測得各種PPCPs的定量限如表2所示，定量限在0.002～0.8 μg/L之間。

向空白水樣中添加112種PPCPs標準溶液在3個水平下進行添加回收試驗(0.2、0.4、0.8 μg/L)，每個水平重復6次。在添加水平為0.2 μg/L時，平均回收率范圍為60.7%～129.5%，相對標準偏差范圍(RSD)為1.4%～17.8%;在添加水平為0.4 μg/L時，平均回收率范圍為60.1%～122.6%，RSD為1.3%～15.8%;在添加水平為0.8 μg/L時的平均回收率范圍為 63.1%～120.1%，RSD為 1.1%～10.7%。

表2 112種PPCPs的線性關系、定量限及提取方法Table 2 Linear relationships，limits of quantification(LOQs)and extraction methods for the 112 PPCPs

表2 (續(xù))Table 2 (Continued)

表2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2．5 實際水樣中PPCPs的分析

將所建立的方法用于來自大連市高新園區(qū)、中山區(qū)、西崗區(qū)、甘井子區(qū)、旅順區(qū)、莊河、普蘭店7個地區(qū)的水樣中PPCPs的分析，每個區(qū)域隨機選擇了1個地點取自來水樣。首先對每個水樣中的PPCPs進行篩查分析，然后分別對樣品中篩查為陽性的化合物進行定量分析。根據(jù)篩查結果可知，共有16種PPCPs化合物分別在7個水樣中被篩查為陽性。具體確證原理以甘井子區(qū)水樣中檢出為陽性的甲氧芐啶為例來說明。如圖2所示，樣品中甲氧芐啶的保留時間(6.00 min)與數(shù)據(jù)庫中標準品一致，一級母離子精確質量數(shù)(291.144 87)與理論值(291.145 17)相差小于 5×10－6，且二級質譜圖中的4個碎片離子(m/z275.112 92，261.097 93，245.102 63，123.066 56)與篩查數(shù)據(jù)庫中標準品的碎片離子也一致，因此可以判斷此樣品中甲氧芐啶為陽性。進一步對這16種PPCPs進行定量分析，結果見表3。

表3 大連市7個區(qū)隨機水樣中篩查為陽性的16種PPCPs的含量Table 3 Mass concentrations of 16 PPCPs in random positive water samples from seven regions in Dalian city ng/L

圖2 某陽性水樣中甲氧芐啶的(a)一級提取離子流圖、(b)二級總離子流圖和(c)二級質譜圖Fig．2 (a)EIC of MS，(b)total ion chromatogram(TIC)of MS/MS and(c)MS/MS profile of trimethoprim detected in a positive water sample

3 結論

本研究發(fā)展了一種快速、簡單的樣品前處理方法，基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜實現(xiàn)了水質中112種PPCPs的快速篩查和定量分析。本方法中我們基于保留時間、母離子及子離子精確相對分子質量建立了112種PPCPs的數(shù)據(jù)庫，用于目標分析物的篩查，并可基于一級母離子提取峰面積實現(xiàn)準確定量。該方法快速、準確，靈敏度高，篩查范圍廣，為水質的風險監(jiān)測提供了一種有力的技術手段，可為食品安全監(jiān)管提供有效的技術保障。