重組 Bacillus stearothermophilus β-CGTase在 β-環(huán)糊精制備中的應(yīng)用條件優(yōu)化

范博望 ， 段緒果 ， 吳 敬 *

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡(jiǎn)稱CD）是一種環(huán)狀低聚糖的總稱，其中較為典型的有α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，它們分別由6、7和8個(gè)葡萄糖殘基組成，每個(gè)葡萄糖殘基之間由1，4-糖苷鍵連接而成[1-3]。由于每個(gè)葡萄糖單元采用了椅形構(gòu)象，環(huán)糊精的形狀像一個(gè)中空的具有親水性外表面的截錐體，因此在水中具有較好的溶解性[4]。并且它中心疏水，外表面親水的結(jié)構(gòu)使得其能夠包埋很多的疏水性分子或者基團(tuán)，從而形成包合物。經(jīng)過(guò)環(huán)糊精包埋以后的分子或基團(tuán)的理化性質(zhì)，比如水溶性、揮發(fā)性、參與化學(xué)反應(yīng)的性能等都會(huì)因此而改變[5]，所以環(huán)糊精在食品、農(nóng)業(yè)、化學(xué)、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用[6]。β-環(huán)糊精由于相對(duì)容易析出、易于分離的特性使得其在3種環(huán)糊精中最易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，簡(jiǎn)稱CGTase）可以作用于淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等葡萄糖聚合物底物，通過(guò)環(huán)化反應(yīng)生成環(huán)糊精。自從CGTase被發(fā)現(xiàn)以后，酶法轉(zhuǎn)化工藝逐漸取代化學(xué)合成法成為環(huán)糊精的主要生產(chǎn)方法。 在大多數(shù)時(shí)候，α-[7]、β-[8-9]、γ-[10-11]環(huán)糊精會(huì)同時(shí)存在于轉(zhuǎn)化體系中，以占比最大的環(huán)糊精作為主要產(chǎn)物可以將CGTase分為α-CGTase、β-CGTase和γ-CGTase。此外，由于不同的有機(jī)溶劑可以選擇性地沉淀目標(biāo)環(huán)糊精，從而使得反應(yīng)平衡向主要生成某單一環(huán)糊精的方向移動(dòng)。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，除選擇相應(yīng)的CGTase以外，還需要添加對(duì)應(yīng)的有機(jī)溶劑來(lái)提高某一環(huán)糊精的比例。如制備α-環(huán)糊精時(shí)常用的癸醇[12]，制備β-環(huán)糊精時(shí)使用的環(huán)己烷、甲苯、叔丁醇[13]，制備γ-環(huán)糊精時(shí)使用的環(huán)十二酮[11]等，都能有效的提高目標(biāo)環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率。然而，環(huán)糊精制備時(shí)常用的淀粉原料中通常含有80%左右的支鏈淀粉，支鏈淀粉中除含有α-1，4-葡萄糖苷鍵外。還含有一定比例的α-1，6-葡萄糖苷鍵，CGTase能夠水解α-1，4-葡萄糖苷鍵，但是不能水解α-1，6-葡萄糖苷鍵，因此在不添加淀粉脫支酶的條件下，難以對(duì)淀粉進(jìn)行徹底的轉(zhuǎn)化。為了解決上述問題，Rendleman建立了先添加普魯蘭酶或異淀粉酶對(duì)淀粉進(jìn)行預(yù)處理，然后再加入CGTase進(jìn)行轉(zhuǎn)化的二步法酶轉(zhuǎn)化工藝[14]。該方法可以有效地提高環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率，但是由于第一步脫支反應(yīng)之后會(huì)形成大量的結(jié)晶狀態(tài)的直鏈淀粉，導(dǎo)致第二步轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)達(dá)7 d以上。為了解決上述問題，江南大學(xué)的段緒果[12]、王磊[10]等分別將異淀粉酶與α-CGTase或γ-CGTase進(jìn)行復(fù)配，建立了脫支與環(huán)化反應(yīng)相偶聯(lián)的同步轉(zhuǎn)化工藝，顯著地地提升了α-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度。但是，關(guān)于普魯蘭酶或異淀粉酶與β-CGTase復(fù)配同步轉(zhuǎn)化淀粉制備β-環(huán)糊精的報(bào)道還未見報(bào)道。

作者所在研究室在前期研究中曾經(jīng)試圖利用異淀粉酶與β-CGTase進(jìn)行同步轉(zhuǎn)化制備β-環(huán)糊精，但是轉(zhuǎn)化率沒有明顯提高。為解決上述問題，作者在制備重組β-CGTase的基礎(chǔ)上，首次對(duì)單酶法制備β-環(huán)糊精的條件進(jìn)行了優(yōu)化；在此基礎(chǔ)上，將重組β-CGTase與作者所在研究室自己制備的普魯蘭酶進(jìn)行復(fù)配，建立了同步脫支環(huán)化高效生產(chǎn)β-環(huán)糊精的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及酶液

產(chǎn)嗜熱脂肪芽孢桿菌β-CGTase的重組短小芽孢桿菌：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；普魯蘭粗酶液：作者所在實(shí)驗(yàn)室制備并保存，酶活力約為1 200 U/mL。

1.2 培養(yǎng)基

TM 培養(yǎng)基（g/L）：多聚蛋白胨 10，牛肉粉 5，酵母粉2，葡萄糖10；pH 7.0，新霉素終質(zhì)量濃度10 μg/mL。

1.3 主要試劑

多聚蛋白胨：BBI公司；牛肉粉、酵母粉：英國(guó)Oxoid公司；分析純?chǔ)?、β-、γ-環(huán)糊精：美國(guó)Sigma公司；甘油、葡萄糖等各種國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭簢?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶

將實(shí)驗(yàn)室保存的菌株以0.1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至TM培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。然后以5%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至50 mL TM培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液離心去除菌體，上清液即為環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。

1.5 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶β-環(huán)化活力的測(cè)定

由于酚酞可以被β-環(huán)糊精包埋，包埋前后的吸光度會(huì)發(fā)生變化，因此可以采用比色法測(cè)定酶活[15-16]。用25 mmol/L、pH 5.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液配制1%的可溶性淀粉為底物，取2 mL底物溶液，50℃水浴10 min，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，以只加緩沖液的體系作為對(duì)照。精確反應(yīng)10 min后，加入0.2 mL、0.6 mol/L HCl終止反應(yīng)。然后，加入0.5 mL、0.6 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié) pH 至 10.0。將反應(yīng)體系溫度調(diào)節(jié)到25℃后，加入0.2 mL、1.2 mmol/L酚酞溶液并顯色15 min，然后在550 nm處測(cè)定吸光值。一個(gè)酶活單位（U）定義為在上述測(cè)定條件下1 min內(nèi)生成1 μmol β-環(huán)糊精所需要的酶量。

1.6 β-環(huán)糊精的生產(chǎn)方法

使用去離子水溶解配置15 g/dL的淀粉懸液，攪拌并加熱至70～80℃，以1 U/g干淀粉的用量加入β-CGTase粗酶液，液化10 min，冷卻至室溫后用5 mol/L NaOH及鹽酸調(diào)節(jié)pH至指定范圍。然后再加入β-CGTase酶液 （5～15 U/g底物）及體積分?jǐn)?shù)5%環(huán)己烷，充分混勻后在恒溫、150 r/min水浴搖床中反應(yīng)24 h。轉(zhuǎn)化結(jié)束后通過(guò)沸水浴加熱滅酶，蒸餾除去環(huán)己烷，蒸餾液與純乙腈1∶1混勻，靜置2 h，12 000 r/min離心30 min，除去未轉(zhuǎn)化的糊精及淀粉，然后采用HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的成分及含量。

1.7 β-環(huán)糊精測(cè)定方法及轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

產(chǎn)物中的β-環(huán)糊精含量采用高效液相色譜來(lái)檢測(cè)。色譜條件為：Agilent1200 HPLC色譜儀，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱為Thermo NH2-APS2 250 mm×4.6 mm，示差檢測(cè)器為 Agilent 2410；流動(dòng)相采用體積分?jǐn)?shù)70%乙腈溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫設(shè)定為40℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的搖瓶發(fā)酵制備

將保存于-80℃的菌種以0.1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至TM培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。再以5%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至50 mL TM培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔12小時(shí)取樣測(cè)酶活，將酶活隨著時(shí)間變化的曲線繪制成圖，結(jié)果見圖1。隨著時(shí)間的推移，重組β-CGTase酶活不斷增加，誘導(dǎo)48 h達(dá)到最高酶活49 U/mL，繼續(xù)增加培養(yǎng)時(shí)間，胞外酶活開始緩慢下降。

圖1 重組菌在搖瓶發(fā)酵中的產(chǎn)酶曲線Fig.1 Fermentation process of the recombinant Brevibacillus sp.in shake flask

2.2 底物質(zhì)量濃度對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響

以淀粉為底物制備β-環(huán)糊精時(shí)，轉(zhuǎn)化率會(huì)隨著底物質(zhì)量濃度的增加而降低，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度低時(shí)，雖然轉(zhuǎn)化率較高，但是綜合成本較高，并不適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[17]。

為了考察上述工藝條件下不同底物質(zhì)量濃度生產(chǎn)環(huán)糊精的情況，找到適合工業(yè)化生產(chǎn)的底物質(zhì)量濃度，使用去離子水懸浮馬鈴薯淀粉并調(diào)節(jié)pH至6.8，然后加入1 U/g底物的β-CGTase液化?？刂痞?CGTase加酶量為5 U/mL，加入體積分?jǐn)?shù)5%環(huán)己烷，在40℃下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化，測(cè)定其酶轉(zhuǎn)化后的β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。隨著馬鈴薯淀粉質(zhì)量濃度的增大，α-環(huán)糊精比例越來(lái)越高，產(chǎn)物特異性降低。當(dāng)?shù)矸鄣孜镔|(zhì)量濃度為15 g/dL時(shí)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率達(dá)到62.2%，β-環(huán)糊精占比為88.6%?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)節(jié)省資源、降低成本的原則，在之后的試驗(yàn)中選擇15 g/dL底物濃度作為標(biāo)準(zhǔn)。

表1 底物質(zhì)量濃度對(duì)環(huán)糊精制備的影響Table 1 Effectofcassava starch concentration on cyclodextrin production

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)時(shí)間與酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速度有關(guān)。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)發(fā)生偶合反應(yīng)，降低轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度，使得反應(yīng)副產(chǎn)物增多；轉(zhuǎn)化時(shí)間短，反應(yīng)進(jìn)行的不徹底，轉(zhuǎn)化率就會(huì)偏低[7]。

為了探究反應(yīng)時(shí)間對(duì)β-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響，使用去離子水懸浮馬鈴薯淀粉并調(diào)節(jié)pH至6.8，然后加入1 U/g底物的β-CGTase液化控制β-CGTase加酶量為5 U/mL，添加體積分?jǐn)?shù)5%環(huán)己烷，在40℃下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化，結(jié)果見表2。隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率及β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率會(huì)一直上升至18 h左右，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率最大達(dá)到64.4%，β-環(huán)糊精占比89.5%，之后轉(zhuǎn)化率便不再上升。為節(jié)約成本，增加生產(chǎn)強(qiáng)度，反應(yīng)時(shí)間被確定為18 h。

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)環(huán)糊精生產(chǎn)的影響Table 2 Effect of time on cyclodextrin production

2.4 初始pH對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)過(guò)程中的pH對(duì)酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)有著重要的影響，因?yàn)閜H會(huì)影響酶活性中心的基團(tuán)解離程度，從而影響酶與底物分子的結(jié)合，進(jìn)而影響最終的轉(zhuǎn)化效果。只有在合適的pH下，底物分子才能和酶最好地結(jié)合，使酶反應(yīng)速率達(dá)到最高[18-19]。

為了探究不同pH對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響，使用NaOH和稀鹽酸調(diào)節(jié)液化后淀粉溶液pH分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，控制 β-CGTase 加酶量為5 U/mL，環(huán)己烷體積分?jǐn)?shù)5%，在40℃下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化，結(jié)果見表3。在pH為4.0時(shí)，環(huán)糊精的總轉(zhuǎn)化率只有43.0%，并且其中β-環(huán)糊精所占比例只有54.6%，產(chǎn)物特異性低；隨著pH值的升高，環(huán)糊精的總轉(zhuǎn)化率逐漸升高，并且β-環(huán)糊精所占比例也逐漸升高，產(chǎn)物特異性更高。當(dāng)pH為6.0時(shí)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到68.1%，并且β-環(huán)糊精約占其中的87.2%。同時(shí)也可以看出，當(dāng)pH在6.0～7.0時(shí)，β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率保持在較高水平。這或許是由于來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是一種偏中性的酶，其最適pH為6.5，因此在pH 6.0～7.0時(shí)，該酶相對(duì)穩(wěn)定，其活性中心的解離程度良好，從而具有較好的催化效果。

表3 反應(yīng)pH對(duì)環(huán)糊精生產(chǎn)的影響Table 3 Effect of pH on cyclodextrin production

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響

溫度會(huì)影響到酶的穩(wěn)定性及催化速率，因此考察溫度對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響。液化完成后調(diào)節(jié)pH為6.0，β-CGTase加酶量為5 U/mL，環(huán)己烷體積分?jǐn)?shù)為5%，結(jié)果見表4。在50℃下，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率及β-環(huán)糊精所占比例均達(dá)到最高，分別為69.8%和96.6%。而在60℃時(shí)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率及β-環(huán)糊精所占比例只有61.5%和97.4%，這可能是由于溫度影響了反應(yīng)過(guò)程中的分子結(jié)合力和活化能。該酶在60℃時(shí)熱穩(wěn)定性變差?？梢钥闯?，隨著溫度升高，β-環(huán)糊精在產(chǎn)物中所占的比例越大，產(chǎn)物特異性越好，這可能是因?yàn)闇囟仍礁?，越利于環(huán)己烷對(duì)β-環(huán)糊精的包埋。綜合以上因素，選用50℃的作為后續(xù)研究的反應(yīng)溫度。

表4 反應(yīng)溫度對(duì)環(huán)糊精生產(chǎn)的影響Table 4 Effect of temperature on cyclodextrin production

2.6 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶加酶量對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響

β-CGTase是一種具有環(huán)化、偶合、歧化和水解4種活力的多功能型酶，4種活力在反應(yīng)體系中同時(shí)存在并且相互影響，其相互作用關(guān)系與反應(yīng)體系中β-CGTase的加量有關(guān)，因此轉(zhuǎn)化率會(huì)受到β-CGTase加酶量的影響[19]。

作者通過(guò)加入不同量的β-CGTase來(lái)探究其對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見表5。當(dāng)加酶量為3 U/g底物時(shí)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率及β-環(huán)糊精比例都最低?？赡苁谴藭r(shí)過(guò)低的加酶量使得切割淀粉的水解活力跟不上形成環(huán)糊精的環(huán)化活力。而當(dāng)加酶量為15 U/g底物時(shí)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率及β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率均出現(xiàn)下降，可能是此時(shí)環(huán)化活力已經(jīng)飽和，而水解、歧化與耦合活性隨著加酶量的增加進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致生成的環(huán)糊精又被轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物。而當(dāng)加酶量為13 U/g底物時(shí)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率最高，為73.9%，此時(shí)，β-CD比例為98.7%。綜合考慮，β-CGTase添加量為13 U/g底物。

表5 CGTase加酶量對(duì)環(huán)糊精生產(chǎn)的影響Table 5 Effect of α-CGTaseconcentration on cyclodextrin production

2.7 普魯蘭酶加酶量對(duì)β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響

普魯蘭酶可以對(duì)馬鈴薯淀粉的支鏈進(jìn)行脫支，形成的之鏈淀粉更有利于CGTase的環(huán)化，提高轉(zhuǎn)化率。但是脫支后的淀粉比脫支前的支鏈淀粉溶解度更低，因此當(dāng)普魯蘭酶加量過(guò)大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致淀粉脫支形成的直連淀粉析出形成結(jié)晶，使得最終轉(zhuǎn)化率降低。

為了確定最適的普魯蘭酶加量，作者考察了在之前優(yōu)化的條件下不同普魯蘭酶加量時(shí)β-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表6。環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率隨著普魯蘭酶加量的增多先上升后下降。當(dāng)普魯蘭酶用量為50 U/g底物時(shí)，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.4%，β-CD所占比例為97.7%。綜合考慮，將普魯蘭酶的加酶量定為50 U/g底物。

表6 普魯蘭酶加酶量對(duì)環(huán)糊精生產(chǎn)的影響Table 6 Effect of pulullanase concentration on cyclodextrin production

3 結(jié) 語(yǔ)

作者將產(chǎn)嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillus stearothermophilus的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組短小芽孢桿菌在搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，胞外發(fā)酵液中酶活最大為49 U/mL。使用該酶制備β-環(huán)糊精時(shí)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化底物濃度、反應(yīng)時(shí)間、初始pH、反應(yīng)溫度、β-CGTase加酶量，發(fā)現(xiàn)在底物質(zhì)量濃度為15 g/dL，初始pH為 6.0，在 50℃下加入 13 U/g底物的CGTase時(shí)，經(jīng)過(guò)18 h的轉(zhuǎn)化，環(huán)糊精的總轉(zhuǎn)化率最高為73.9%，其中β-環(huán)糊精占98.7%。在此基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中添加普魯蘭酶使得淀粉脫支與β-CGTase的環(huán)化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，優(yōu)化后普魯蘭酶的最適加酶量為50 U/g底物，在最優(yōu)條件下環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率提升至81.4%，其中β-環(huán)糊精占比97.7%。