銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)理

王 倩 ， 藍(lán)蔚青 *， 侯 旻 ， 張皖君 ， 謝 晶

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

銀杏 （Ginkgo biloba）為銀杏科銀杏屬裸子植物，俗稱白果樹(shù)、公孫樹(shù)等，是中國(guó)最古老的樹(shù)種之一，有“活化石”之稱[1]。相關(guān)研究證明，銀杏葉中含有200多種藥用成分，其中包含46種黃酮類活性成分、25種微量元素、17種氨基酸和生物堿等，具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、擴(kuò)張血管、保護(hù)心臟、抗氧化、抗腫瘤等作用，保健價(jià)值高[2-4]。

近年來(lái)，研究人員對(duì)銀杏葉提取工藝、提取物的化學(xué)成分、藥理作用和藥動(dòng)學(xué)等方面研究取得了一定進(jìn)展[5]。部分研究表明，銀杏葉提取物中的銀杏酚酸具有抑菌殺菌作用，對(duì)此，部分學(xué)者對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究。Sati等[6]研究了不同溶劑（甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、水）提取的銀杏葉提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌及真菌的抑菌活性，結(jié)果表明銀杏葉提取物對(duì)細(xì)菌作用最強(qiáng)，放線菌次之，且甲醇提取物的抑菌效果最好。曲莉等[7]通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑和最低抑菌濃度研究了銀杏葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用，最終得出銀杏葉提取物對(duì)兩者均有明顯抑制作用?，F(xiàn)有研究主要集中于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等常見(jiàn)致病菌，但對(duì)水產(chǎn)品中腐敗菌的抑制作用及作用機(jī)理方面的研究較少，抑菌機(jī)制也不明確。作者以水產(chǎn)品腐敗菌——腐生葡萄球菌為研究對(duì)象，測(cè)定了銀杏葉提取液對(duì)其的最小抑菌濃度與抑菌率的影響，并研究其對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞壁完整性與菌體形態(tài)的影響，進(jìn)一步分析銀杏葉提取液的抑菌作用機(jī)理，為后期將其應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銀杏葉：摘自上海海洋大學(xué)校園主環(huán)路上。8月份選取新鮮、無(wú)病蟲(chóng)害、葉面扇形、邊緣完整的銀杏葉進(jìn)行采摘。采摘后將其清洗、烘干、粉碎后保存?zhèn)溆谩?/p>

供試菌株：腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）為作者所在課題組前期從腐敗鯧魚(yú)中分離、篩選并鑒定保存菌株。

主要試劑：胰蛋白胨大豆肉湯 （Tryptic Soy Broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）培養(yǎng)基：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所；其他化學(xué)試劑氯化鈉、無(wú)水乙醇、戊二醛等：均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；BCD-256KF冰箱：青島海爾股份有限公司；ZQZY-70B振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；MLS-3750滅菌鍋：日本SANYO公司；Synergy2自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司；DDB-11A電導(dǎo)率儀：杭州齊威儀器有限公司；S3400N掃描電子顯微鏡：Hitachi日本株式會(huì)社；全M334712自動(dòng)微生長(zhǎng)曲線分析儀：芬蘭Bioscreen公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

銀杏葉提取液制備稱取10 g銀杏葉粉末，加入500 mL 60%乙醇，混合后在60℃下超聲波提取30 min，冷凍離心后進(jìn)行抽濾，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇和水，濃縮至最終體積為20 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，得到質(zhì)量濃度為500 mg/mL的銀杏葉提取液。

菌懸液的制備挑取活化后的腐生葡萄球菌單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7 h，用滅菌生理鹽水將其配制成含菌數(shù)106～107CFU/mL的菌懸液備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 最 小 抑 菌 濃 度 （MinimalInhibitory Concentration，MIC） 采用肉湯稀釋法[8]和平板計(jì)數(shù)法[9]測(cè)定銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的MIC值，以特定環(huán)境下孵育24 h，可抑制微生物出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)的最低濃度即最小抑菌濃度。通過(guò)梯度稀釋將銀杏葉提取液用無(wú)菌TSB在試管中依次稀釋，使各組終質(zhì)量濃度分別為 300、250、200、150、100、50 mg/mL，對(duì)照組用無(wú)菌水代替銀杏葉提取液。向各組接種菌懸液達(dá)最終濃度為106CFU/mL，取100 μL用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，選取合適稀釋液100 μL均勻涂布于TSA平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將試管置于37℃搖床中恒溫培養(yǎng)24 h，再次進(jìn)行稀釋、涂布、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。通過(guò)比較銀杏葉提取液處理前后菌數(shù)變化，得出最小抑菌濃度（MIC）。

抑菌率向無(wú)菌96孔板中分別加入MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液，并接種一定量已制備的菌懸液，使孔中溶液含菌量為106CFU/mL。充分混勻后置于37℃微孔板振蕩器中培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀測(cè)其600 nm處的吸光度值，計(jì)算其抑菌率[10]：

式中，ODR為對(duì)照孔吸光值；OD為樣品孔吸光值；ODB為空白孔吸光值。

細(xì)菌生長(zhǎng)曲線將已制備的供試菌菌懸液按1%接種體積分?jǐn)?shù)分別加至MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液中，以不加銀杏葉提取液組為對(duì)照組。37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，用全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀每隔30分鐘自動(dòng)取樣，測(cè)其620 nm處的OD值。以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌抑制作用的生長(zhǎng)曲線。

細(xì)胞膜通透性通過(guò)培養(yǎng)液中電導(dǎo)率的變化，表征銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌菌體細(xì)胞膜通透性的影響。將已制備的供試菌菌懸液按1%接種體積分?jǐn)?shù)分別加入到MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液中，以不加銀杏葉提取液組作為對(duì)照。37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng) 12 h，參考 Tao等[11]法，每隔2小時(shí)取樣，測(cè)其電導(dǎo)率。

細(xì)胞膜完整性當(dāng)菌體細(xì)胞膜完整性遭到破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化反映細(xì)胞膜完整性的破壞程度。制備菌懸液后，分別加入MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液，以不加銀杏葉提取液組為對(duì)照。37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h，每隔2小時(shí)取培養(yǎng)液，8 000 r/min離心3 min，取上清液用考馬斯亮藍(lán)法[12]測(cè)其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞壁的影響參考藍(lán)蔚青等[13]方法，將已制備的供試菌液按1%接種體積分?jǐn)?shù)加入到MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液中，以不加銀杏葉提取液組為對(duì)照。37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h，每隔2小時(shí)取樣，3 500 r/min離心10 min，取上清液用測(cè)試盒進(jìn)行堿性磷酸酶（AKP）的測(cè)定。

掃描電鏡觀察向MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液中接種體積分?jǐn)?shù)1%已制備好的供試菌液，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h，取菌液1.5 mL在4℃、8 000 r/min離心5 min，收集沉淀。用2.5%戊二醛溶液使菌體沉淀重懸浮，在4℃固定10 h。將固定后的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后，分別用30%、50%、70%、90%、無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度脫水。冷凍干燥12 h后，將其涂至金屬載體上，噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過(guò)SPASS17.0軟件用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性差異分析（p＜0.05），通過(guò)Origin8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）

如表1所示，銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌有較好的抑制作用。當(dāng)銀杏葉提取液質(zhì)量濃度≥200 mg/mL時(shí)，腐生葡萄球菌無(wú)菌落生長(zhǎng)。當(dāng)銀杏葉提取液質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，菌體數(shù)量未出現(xiàn)明顯上升。因此，銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的MIC為100 mg/mL。此結(jié)果與白秀君等[14]研究荷葉提取液對(duì)大腸桿菌的MIC為125 mg/mL結(jié)果相似。

2.2 抑菌率

計(jì)算得出MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌率分別為60.58%和81.34%，這一結(jié)果也表明銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌有較好的抑制作用。

表1 銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of Ginkgo biloba leaf extracts against Staphylococcus saprophyticus

2.3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

將MIC、2MIC質(zhì)量濃度銀杏葉提取液處理的腐生葡萄球菌與正常生長(zhǎng)腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of Ginkgo biloba leaf extracts on the growth of Staphylococcus saprophyticus

由圖1可知，銀杏葉提取液處理組的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線發(fā)生了明顯變化。在0～4 h內(nèi)，MIC、2MIC質(zhì)量濃度銀杏葉提取液處理組的細(xì)菌數(shù)量未出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)，在4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，其細(xì)菌數(shù)量也明顯低于正常生長(zhǎng)的腐生葡萄球菌。因此，銀杏葉提取液可顯著抑制細(xì)菌的菌體分裂，減緩其繁殖速度，延緩菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而抑制菌體生長(zhǎng)。

2.4 細(xì)胞膜通透性

細(xì)胞膜是 Na+、K+、Ca2+等離子的通透性屏障，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分可影響這些小分子物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，可造成其離子滲漏，從而影響菌體的細(xì)胞膜功能和生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。表2反映了銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響。

如表2所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中電導(dǎo)率有顯著性差異（p＜0.05）。經(jīng)MIC、2MIC質(zhì)量濃度銀杏葉提取液處理的兩組菌液中電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明銀杏葉提取液可破壞菌體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞中金屬離子外泄，抑制細(xì)菌正常生長(zhǎng)代謝，造成菌體死亡。對(duì)照組的培養(yǎng)液中電導(dǎo)率也有上升趨勢(shì)，可能是由于菌體細(xì)胞的自溶和死亡[12]。

2.5 細(xì)胞膜完整性

蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)是細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的重要單位結(jié)構(gòu)物質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，這些大分子物質(zhì)被釋放出來(lái)，影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝，從而抑制細(xì)菌繁殖[12]。圖2反映了銀杏葉提取液對(duì)菌體細(xì)胞膜完整性的影響。

如圖2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度相對(duì)穩(wěn)定，而MIC、2MIC質(zhì)量濃度銀杏葉提取液處理組的培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度迅速增大，呈明顯上升趨勢(shì)。說(shuō)明經(jīng)銀杏葉提取液處理的菌體細(xì)胞膜完整性受到破壞，蛋白質(zhì)大量泄漏，影響了其正常生長(zhǎng)繁殖。菌體培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的上升趨勢(shì)與張赟彬等[12]研究結(jié)果一致。

2.6 銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞壁的影響

堿性磷酸酶（AKP）是一種水解酶，可催化β-甘油磷酸酯等有機(jī)磷酸單酯的水解，釋放無(wú)機(jī)磷酸鹽，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，對(duì)生物體內(nèi)物質(zhì)代謝有重要作用[16]。由于其存在于細(xì)胞膜與細(xì)胞壁間、與細(xì)胞膜相結(jié)合，所以當(dāng)細(xì)胞壁遭到破壞時(shí)，在胞外可檢測(cè)到堿性磷酸酶的存在。

表2 銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響Table 2 Effects of Ginkgo biloba leaf extracts on the membrane permeability of Staphylococcus saprophyticus

圖2 銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.2 Effects of Ginkgo biloba leaf extracts on the membrane integrity of Staphylococcus saprophyticus

如圖3所示，對(duì)照組中堿性磷酸酶量基本未發(fā)生變化，而經(jīng)MIC、2MIC銀杏葉提取液處理后，菌懸液中的堿性磷酸酶量變化明顯。經(jīng)銀杏葉提取液處理2 h后，其堿性磷酸酶量顯著升高，在處理6 h后達(dá)到最大值，隨后降低直至趨于平穩(wěn)。結(jié)果表明，菌體經(jīng)銀杏葉提取液作用后，菌體細(xì)胞壁受損嚴(yán)重，內(nèi)容物滲出，導(dǎo)致胞外的堿性磷酸酶量明顯升高。此結(jié)果變化趨勢(shì)與藍(lán)蔚青等[17]研究結(jié)果相似。

圖3 銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌菌體細(xì)胞壁的影響Fig.3 Effects of Ginkgo biloba leaf extracts on the cell wall of Staphylococcus saprophyticus

2.7 掃描電鏡分析

掃描電鏡圖可從細(xì)菌的菌體形態(tài)上直觀反映銀杏葉提取液的抑菌機(jī)理。銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的作用電鏡結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 對(duì)照組和銀杏葉提取液處理6 h的腐生葡萄球菌掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of Staphylococcus saprophyticus treated by Ginkgo biloba leaf extracts for 6 h

由圖4可知，未經(jīng)銀杏葉提取液處理的腐生葡萄球菌菌體細(xì)胞呈圓潤(rùn)球狀、表面光滑，細(xì)胞聚集成葡萄串狀，細(xì)胞間界限明顯。而經(jīng)銀杏葉提取液處理6 h后，菌體細(xì)胞呈無(wú)規(guī)律排列，細(xì)胞大小不一、部分菌體細(xì)胞相互粘結(jié)，菌體細(xì)胞周圍有小分子物質(zhì)聚集。說(shuō)明銀杏葉提取液可通過(guò)抑制菌體細(xì)胞壁的合成或破壞細(xì)胞壁、改變細(xì)胞膜通透性來(lái)影響細(xì)菌的正常生長(zhǎng)代謝，從而實(shí)現(xiàn)抑菌效果。

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)最小抑菌濃度、抑菌率、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率與堿性磷酸酶量測(cè)定，結(jié)合掃描電鏡觀察菌體形態(tài)，研究了銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明：銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為100 mg/mL，MIC、2MIC質(zhì)量濃度的銀杏葉提取液對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌率分別為60.58%和81.34%。各指標(biāo)測(cè)定和掃描電鏡結(jié)果表明，銀杏葉提取液可抑制菌體細(xì)胞分裂繁殖，延緩其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性使細(xì)胞膜通透性增大，破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜完整性，使細(xì)胞內(nèi)容物外泄，抑制菌體正常生長(zhǎng)代謝，造成菌體死亡。通過(guò)以水產(chǎn)品特定腐敗菌——腐生葡萄球菌為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為銀杏葉提取液應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮貯藏，為其向著天然、安全的方向發(fā)展提 供理論基礎(chǔ)與研究思路。