固定時間不同的大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片酶消化技術改進研究

李玉明 王現(xiàn)軒 田蒙鴿 趙博厚 李永勝 劉建軻 蘇衍萍

(泰山醫(yī)學院，山東 泰安 271016)

視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的改變是視網(wǎng)膜病變的顯著特點，所以視網(wǎng)膜消化鋪片技術在視網(wǎng)膜病變研究中占有不可或缺的地位。但由于消化、展片等操作技術較為困難，消化鋪片的成功率較低。目前常規(guī)采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化的方法對短期保存的視網(wǎng)膜組織進行消化鋪片。但由于實驗研究中的各種原因常導致標本固定時間過長，加大了制片難度。本研究中，我們將國內外各種經(jīng)驗進行總結，全程應用恒溫搖床，采用酶聯(lián)合消化技術，探索不同固定時間的大鼠視網(wǎng)膜最適的酶消化濃度和消化時間，為視網(wǎng)膜血管病變的研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠(濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司)；Proteinase K (中山金橋)；Trypsin 1∶ 250 (Blotopped);蘇木素、伊紅染色液、馬來酸、Tris、鹽酸及氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純(天津市凱通化學試劑有限公司)；LZY系列恒溫搖床(常州諾基儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1取材及固定

正常SD大鼠12只，頸椎脫臼法處死后，摘取眼球，隨機分3組于4%甲醛溶液中固定2天、3個月及7個月。

1.2.2消化液的配置

0.1%蛋白酶K消化液的配置：首先配置Tris-HCl緩沖液：取Tris 1.21 g、蒸餾水8 ml、鹽酸0.6 ml，蒸餾水定容至10 ml，稀釋100倍后，調節(jié)pH為7.4～8即可。用Tris-HCl緩沖液配置0.1%蛋白酶K消化液。胰蛋白酶消化液的配置：分別取1 mol/L馬來酸溶液10 ml，1 mol/L Tris 溶液10 ml和0. 5 mol/L NaOH 溶液24 ml，加蒸餾水稀釋至100 ml，調節(jié)pH 為7.8，配制成Tris-Maleic 緩沖液。用Tris-Maleic 緩沖液配制3%、6%、9%胰蛋白酶消化液[1-2]。配制好的蛋白酶K消化液及胰蛋白酶消化液均置于4℃保存。

1.2.3視網(wǎng)膜鋪片的制備

將固定好的眼球取出，用眼科剪沿距齒緣剪開鞏膜，置于PBS中小心去除眼前節(jié)和晶狀體，以視神經(jīng)乳頭為中心將眼球壁均勻分成3份，輕輕分離視網(wǎng)膜，并將視網(wǎng)膜在PBS中浸洗12 h。12 h之后將視網(wǎng)膜置入蒸餾水中，37℃孵育1 h，蒸餾水漂洗。孵育后的視網(wǎng)膜每組再隨機分為兩份，分別進行常規(guī)胰蛋白酶消化和蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化。

胰蛋白酶消化法中，首先將孵育后的視網(wǎng)膜放入胰蛋白酶消化液中，濃度參考文獻并加以調整[1]。固定2天的視網(wǎng)膜置于3%胰酶消化液中，固定3個月的視網(wǎng)膜置于6%胰酶消化液中，固定7個月的視網(wǎng)膜置于9%胰酶消化液中。并將視網(wǎng)膜在恒溫搖床中37℃、70 r/min進行消化。

蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法中，先將漂洗后的視網(wǎng)膜放入0.1%的蛋白酶K中[2]，恒溫搖床56℃、70 r/min消化13～20 min，消化后蒸餾水漂洗。因固定時間不同，消化時間需以感光層細胞脫落時為準。漂洗后，將視網(wǎng)膜置于胰蛋白酶消化液中，胰蛋白酶濃度與常規(guī)胰蛋白酶消化法相同，再將視網(wǎng)膜在恒溫搖床中37℃、70 r/min進行第二次消化。

兩種消化法均以視網(wǎng)膜神經(jīng)組織消化完全為標準記錄消化時間。消化結束后，在蒸餾水中輕輕吹打，去除粘附在視網(wǎng)膜血管網(wǎng)上的細胞。用吸管將消化后的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)移至防脫片上，輕輕震蕩，待其基本展開后，用吸管輕輕吸取防脫片上的蒸餾水，依靠蒸餾水的輕微流動將視網(wǎng)膜血管網(wǎng)完全展開,自然干燥。

1.2.4視網(wǎng)膜血管鋪片HE染色

視網(wǎng)膜血管鋪片HE染色方法參考文獻[2]，中性樹脂封片后鏡下觀察。

1.2.5統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 不同固定時間的視網(wǎng)膜消化時間

不同固定時間的視網(wǎng)膜分別行常規(guī)胰蛋白酶消化和蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化。消化時間見表1。

表1 不同固定時間的視網(wǎng)膜消化時間一覽表

2.2 消化后視網(wǎng)膜血管鋪片染色結果

消化完成，經(jīng)HE染色后的視網(wǎng)膜血管鋪片(圖1)可見，固定2天、3個月的視網(wǎng)膜在兩種消化方法中，成片效果基本相同，血管網(wǎng)鋪片完整，各級血管形態(tài)、走向清晰，無斷裂，血管內皮細胞形態(tài)及細胞核均清晰顯示，但聯(lián)合消化法消化的更為徹底幾乎無其他組織殘留。固定7個月的視網(wǎng)膜，采用單純胰蛋白酶消化的，存在血管斷裂現(xiàn)象，而采用聯(lián)合消化法的視網(wǎng)膜血管斷裂現(xiàn)象優(yōu)于前者。但可能因為胰酶濃度高、消化時間長的原因，導致組織細胞損傷，固定7個月的視網(wǎng)膜血管胞質染色不均勻，且血管較為曲折，成片效果略差于固定2天、3個月的視網(wǎng)膜。

3 討 論

視網(wǎng)膜鋪片技術是視網(wǎng)膜血管病變研究中必不可缺的重要技術。Kuwabara等人[3]首次于1960年創(chuàng)立了胰蛋白酶消化視網(wǎng)膜的方法，為視網(wǎng)膜血管鋪片研究提供了新的技術手段。1963年Ashton[4]改進Kuwabara的方法，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法成功制備了貓視網(wǎng)膜血管鋪片。此后通過各個學者的研究改進[5-7]，視網(wǎng)膜消化鋪片技術才愈發(fā)完善。

但很多時候，因為實驗設計或實驗室條件等限制，實驗動物取材后并不能及時進行下一步處理，因此導致視網(wǎng)膜在甲醛中保存時間過長，而致后期消化困難。為了解決這一難題，我們對聯(lián)合消化法加以改進[1]，調整了胰蛋白酶的濃度及消化時間，并將消化場所由恒溫箱改為恒溫搖床。

由于長時間固定導致的視網(wǎng)膜消化困難主要表現(xiàn)在消化時間的把握，一方面，消化不完全，導致血管無法充分暴露，影響觀察；另一方面，消化過度又會導致血管斷裂，組織不清。所以消化時間的適當縮短有利于整個消化過程的掌控。在本實驗中，我們通過蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合的方法適當縮短了消化時間，進而做到對消化過程的合理控制。與此同時，聯(lián)合消化法和恒溫搖床技術也提高了消化成片率，這對實驗效率以及成功率有著顯著積極的意義。蛋白酶K能夠快速有效的使組織細胞裂解，因此蛋白酶K可對視網(wǎng)膜感光層細胞進行初步消化。 因為蛋白酶K可透過細胞膜，破壞細胞核，所以視網(wǎng)膜層需漂洗后才可進行第二步消化[2]。

A：固定2天的視網(wǎng)膜；B：固定3月的視網(wǎng)膜；C：固定7月的視網(wǎng)膜；1：胰蛋白酶消化法；2：蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法

在消化過程中，我們還將恒溫箱改為恒溫搖床，不僅省去了人工搖動的步驟，也在一定程度上促進了消化過程的進行。在成片效果上，由于較長消化時間，難控制的消化過程，仍然無法避免組織細胞的損傷，所以在固定7月的視網(wǎng)膜血管中表現(xiàn)為不均勻的胞質染色，成片效果略差。通過對消化濃度的調整，在恒溫搖床中采用聯(lián)合酶消化的方法顯著改善由于固定時間過長而導致的消化困難的問題，并且減少了消化時間，提高了消化成片率，但關于胰蛋白酶的最適消化濃度還需進一步研究。

在視網(wǎng)膜消化鋪片制備中，消化完成的血管網(wǎng)易折疊，單純用外力展開又容易造成血管的斷裂，加大了鋪片的難度。特別是在某些實驗研究中，需要測量視網(wǎng)膜血管面積分析實驗結果，所以在該類實驗中，鋪片技術在一定程度上決定了結果的準確性與完整性。對此，研究組成員進行討論，現(xiàn)將心得陳述如下：首先在防脫片上滴加少量蒸餾水，并將消化完全的視網(wǎng)膜轉移其中，輕微震蕩后使用微量移液槍，沿蒸餾水邊緣緩慢吸取，通過蒸餾水的流動，促使其完全展開，然后再次輕微震蕩載玻片，使因外力過度展開的血管網(wǎng)稍加恢復，但不要將載玻片上的水吸干凈。展片完成后將其自然干燥，即可進行下一步實驗操作。值得注意的是，由于蛋白酶K能穿透細胞膜，破壞細胞核，所以在后期染色過程中應減少核染時間，防止染色過度而影響觀察效果。

通過結合國內外多學者的研究結果并加以調整，應用蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法，并改進胰酶濃度、消化時間及消化場所，解決了長時間固定的視網(wǎng)膜消化問題，穩(wěn)定性較好，得到了和短時間固定組織近乎相同的形態(tài)學結果。但其最適消化濃度和時間，以及該種消化方法是否影響視網(wǎng)膜組織超微結構等方面，還需進一步深入研究。