大鼠頸脊髓半側(cè)挫傷模型的建立及其組織學(xué)變化的研究

劉恩志 嚴(yán) 瀚 董婉華 蘆 虎 陳 斌 梁英杰 郭東明

(廣州市第一人民醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510180)

脊髓損傷可能會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)上肢神經(jīng)功能的永久性損傷，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量[1]，流行病學(xué)調(diào)查顯示，大約40%的脊髓損傷是發(fā)生在頸脊髓段[2]。高危頸椎在臨床上主要表現(xiàn)為部分患者影像學(xué)上存在頸椎椎管狹窄引起脊髓嚴(yán)重受壓卻無(wú)或僅有輕微臨床癥狀，但受到輕微外傷即可能出院嚴(yán)重的癱瘓，被認(rèn)為是頸脊髓受?chē)?yán)重壓迫后的一種亞臨床的臨界代償狀態(tài)。臨床上，高危頸椎的患者僅受到低能量損傷時(shí)即造成嚴(yán)重的頸脊髓損傷，引起嚴(yán)重殘疾，對(duì)患者家屬和社會(huì)帶來(lái)極大心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠頸脊髓損傷模型，觀察其在不同程度脊髓損傷中的組織學(xué)變化，為臨床研究高危頸椎提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物均嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理方法》和《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》法規(guī)并得到當(dāng)?shù)貏?dòng)物倫理委員會(huì)的同意。將80只成年雄性SD大鼠(約260～300 g)，8周齡，遵照隨機(jī)原則分成A(n=30)、B(n=30)和C(n=20)共3組，其中A和B組為實(shí)驗(yàn)組，分別接受1.2 mm及2 mm深度C5脊髓半挫傷手術(shù)，C組為假手術(shù)組，接受半側(cè)椎板切除手術(shù)。術(shù)后對(duì)所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，8周后處死，取材，分析大鼠組織學(xué)變化。

1.2 制備半側(cè)頸C5脊髓挫傷模型鼠

用10%的水合氯醛按照0.3 ml/100 g的劑量將大鼠麻醉，然后在其C5節(jié)段做半側(cè)椎板切除手術(shù)從而讓脊髓暴露出來(lái)，再用特制的椎夾固定C4～6節(jié)段，連接腦立體定位儀。按照李榕等[3]的方法制備大鼠不同程度脊髓損傷模型。模型制備成功后，各組均肌肉注射青霉素，防止術(shù)后感染，再將大鼠單籠飼養(yǎng)，維持溫度在37 ℃左右。脊髓損傷后應(yīng)觀察到大鼠前爪閉合，同側(cè)前肢癱瘓。

1.3 行為學(xué)評(píng)分指標(biāo)

在術(shù)后1、7、14、28、42及56 d按照Cao Y等[4]的方法對(duì)大鼠前肢進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，該評(píng)分方法是以BBB 評(píng)分為基礎(chǔ)進(jìn)行修正，最低分為0，最高分17。具體方法為：將大鼠放在直徑100 cm， 高40 cm左右的曠場(chǎng)中自由活動(dòng)，由高清數(shù)碼相機(jī)記錄大鼠活動(dòng)。采用單盲法，兩名人員分別單獨(dú)評(píng)分，最后采用兩者評(píng)分的平均值作最終評(píng)分。

1.4 組織學(xué)分析

術(shù)后6周用10%的水合氯醛按照0.3 ml/100 g的劑量將大鼠麻醉，取材，依照李榕等[3]的方法切片染色，觀察病理組織學(xué)變化，用Image proplus 5.0計(jì)算脊髓損傷面積及灰質(zhì)和白質(zhì)殘存面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 半側(cè)頸C5脊髓挫傷模型鼠的力學(xué)參數(shù)

一般認(rèn)為最大位移點(diǎn)和脊髓接觸點(diǎn)二者的差值是挫傷位移，根據(jù)載荷和位移的線性關(guān)系，得到挫傷過(guò)程中的挫傷位移以及相應(yīng)的打擊速度和在挫傷過(guò)程中產(chǎn)生的最大打擊力與能量。設(shè)置中度組和重度組的打擊速度均為500 mm/s，中度組打擊后的挫傷位移1.2 mm，重度組打擊后的挫傷位移2 mm。比較兩組在挫傷過(guò)程中產(chǎn)生的最大打擊力與能量發(fā)現(xiàn)，中度組均低于重度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如表1。

2.2 三組大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)分比較

建模后大鼠均出現(xiàn)了顯著的脊髓對(duì)應(yīng)側(cè)前肢功能運(yùn)動(dòng)性缺陷，主要癥狀為前肢不同程度的癱瘓，前爪出現(xiàn)閉合屈曲功能障礙，而對(duì)側(cè)前肢功能未見(jiàn)異常。假手術(shù)組術(shù)后8周每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)評(píng)分均接近滿分17 分，未見(jiàn)前肢出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙。建模成功后1 d，挫傷深度1.2 mm組即中度損傷組模型鼠僅有一個(gè)關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)或者伴有合并其他前肢關(guān)節(jié)的小幅度運(yùn)動(dòng)。在建模后1～4 周時(shí)，中度損傷組大鼠前肢功能基本恢復(fù)，可見(jiàn)大鼠持續(xù)性足掌觸地行走，第28天的評(píng)分為(10.45±1.28)，與損傷后1 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。術(shù)后4周大鼠前肢功能得到恢復(fù)，第8周時(shí)表現(xiàn)為持續(xù)足掌行走，爪在行走的過(guò)程中均與身體保持平行狀態(tài)。而重度損傷組需要較長(zhǎng)時(shí)間獲得前肢功能恢復(fù)。第42 d時(shí)可見(jiàn)重度損傷組大鼠足背觸地行走，評(píng)分為(8.07±0.86)。而在術(shù)后8周時(shí)前肢功能只有部分恢復(fù)，行為學(xué)表現(xiàn)為基本足背觸地行走，間斷性足掌觸地行走，評(píng)分為(8.89±1.05)，相比中度損傷組行為學(xué)評(píng)分較低，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。如表2。

表1 大鼠半側(cè)頸脊髓挫傷打擊參數(shù)

2.3 組織學(xué)結(jié)果

術(shù)后8周，假手術(shù)組脊髓未見(jiàn)損傷，灰、白質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)病理性改變；中度和重度損傷組脊髓灰、白質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理性改變，兩組大鼠脊髓損傷面積以及灰、白質(zhì)殘存面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表2 三組大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

注：#表示與中度組損傷后1 d比較，P<0.001；##表示與中度組損傷后56 d比較，P<0.001。

表3 大鼠脊髓損傷處灰、白質(zhì)殘余面積比較

3 討 論

臨床上脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種常見(jiàn)的、致殘率較高的創(chuàng)傷性疾病，通?；颊咦陨頍o(wú)法恢復(fù)治愈，且發(fā)病率逐年上升。高速打擊造成大鼠的脊髓挫傷是當(dāng)前與臨床上脊髓損傷相關(guān)性最好、最容易獲得的一種研究模型，也是脊柱外科和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域常用的研究模型。臨床上開(kāi)展脊髓損傷的研究無(wú)法依靠系統(tǒng)的研究，因此建立理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是脊髓損傷研究的首要條件。目前脊髓損傷研究領(lǐng)域的挫傷型脊髓損傷模型鼠，在一定程度上和人類(lèi)脊髓損傷的病理和生理特點(diǎn)具有很大的相似性,可以忽略持續(xù)性的擠壓作用產(chǎn)生的影響；有別于挫傷型脊髓損傷，壓迫型脊髓損傷模型是非瞬間損傷, 有利于神經(jīng)功能和代謝改變的研究；而銳性脊髓損傷模型更適于再生性實(shí)驗(yàn)研究, 但與臨床的相關(guān)性較差；除此之外，脊髓缺血及再灌注損傷模型與高速產(chǎn)生的脊髓損傷存在很大的差異，因此不能作為脊髓損傷的臨床研究模型[5]。

本研究通過(guò)挫傷大鼠半側(cè)脊髓建立頸脊髓損傷模型，較正中挫傷損傷輕，且在一定程度上有利于模型鼠損傷后的恢復(fù)和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)觀察研究。通過(guò)效仿Sparrey等[6]建立靈長(zhǎng)類(lèi)脊髓損傷模型的方法，本研究模型鼠的頸脊髓挫傷位置在C5節(jié)段左側(cè)，以此避免脊髓在高速挫傷過(guò)程中發(fā)生移位[7]，確保成功構(gòu)建模型。研究[8]表明在建立其他動(dòng)物頸脊髓挫傷模型中，構(gòu)建的動(dòng)物模型之間的重復(fù)性較差，反映在位移、速度和打擊最大力等參數(shù)上，不同實(shí)驗(yàn)組間存在較大的差異 。因此，本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處在于對(duì)損傷節(jié)段頸椎的固定，以此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不同大鼠之間脊髓挫傷有可重復(fù)性。

本研究通過(guò)前肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)分析不同程度脊髓損傷和大鼠神經(jīng)功能障礙之間存在的關(guān)系，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)脊髓繼發(fā)性損傷對(duì)功能產(chǎn)生一定的影響，表現(xiàn)在組間大鼠傷側(cè)前肢運(yùn)動(dòng)功能在術(shù)后都明顯下降，從第2周開(kāi)始，中度組較重度組傷側(cè)前肢使用率較高，而重度組在短時(shí)間內(nèi)前肢功能障礙改善不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2～4 周是一個(gè)較快的恢復(fù)期，4周之后實(shí)驗(yàn)組基本達(dá)到平臺(tái)期，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)重度挫傷組大鼠仍然表現(xiàn)出一定程度的前肢功能運(yùn)動(dòng)性障礙，與先前關(guān)于頸椎骨折錯(cuò)位模型有類(lèi)似的結(jié)果[9]。盡管如此，重度和中度挫傷組大鼠脊髓功能恢復(fù)到達(dá)平臺(tái)期所需時(shí)間并沒(méi)有顯著性差異，推測(cè)可能是該時(shí)期膠質(zhì)瘢痕形成的緣故，對(duì)神經(jīng)纖維的再生和軸突再髓鞘化產(chǎn)生了抑制作用[10]，同時(shí)組織學(xué)結(jié)果也在一定程度上解釋了行為學(xué)上出現(xiàn)的神經(jīng)功能障礙等癥狀。頸脊髓半側(cè)挫傷的位移和速度決定了白質(zhì)和血脊髓屏障被破壞的程度和范圍，也會(huì)影響脫髓鞘區(qū)域的范圍[11]。本研究行為學(xué)結(jié)果顯示，頸脊髓挫傷的深度與灰白質(zhì)損害存在一定的相關(guān)性，同時(shí)脊髓腹側(cè)組織的破壞也更加明顯。以往的學(xué)者也發(fā)現(xiàn)胸髓損傷中，下肢的運(yùn)動(dòng)功能更依賴(lài)于脊髓白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性[12-13]，本實(shí)驗(yàn)頸脊髓損傷模型鼠的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)分與殘存的白質(zhì)和灰質(zhì)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此可以初步推斷大鼠頸髓損傷后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙與灰白質(zhì)的完整性存在一定的關(guān)系[14-15]。脊髓損傷后的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，研究脊髓損傷的組織病理學(xué)、細(xì)胞和組織化學(xué)以及電生理變化，對(duì)于闡明脊髓損傷的自然病程和探索新的治療方法有極為重要的指導(dǎo)意義。