矮牽牛PhTPS5基因的克隆與表達(dá)分析

劉 娜，王 琦，劉同瑞，熊 楓，張水明，董麗麗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥 230036)

分枝發(fā)育是決定植物地上部分形態(tài)建成的重要因素，是植物適應(yīng)環(huán)境，競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，提高自身產(chǎn)量和觀賞性狀的有效手段。植物的分枝起源于腋生分生組織，形成于葉腋部位。腋生分生組織起始后產(chǎn)生葉片形成腋芽，新形成的腋芽可以繼續(xù)萌發(fā)，也可以進(jìn)入休眠。而休眠的腋芽在受到內(nèi)部因素或外部因素的影響后會(huì)重新被激活開(kāi)始萌發(fā)[1]。

研究表明：生長(zhǎng)素在莖中耗減的速度不足以引起去頂后芽的快速生長(zhǎng)；而去除頂端的同時(shí)去除葉片，腋芽并不能快速萌發(fā)；放射性同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示去除頂端后糖分能夠快速地向腋芽聚集[2]。在完整植株中，外源施加糖能夠快速誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，改變生長(zhǎng)素含量而不改變糖含量則并不能影響腋芽的萌發(fā)。因此，糖分在腋芽中的快速積累是腋芽后續(xù)萌發(fā)的必備條件[2]。Mason等[2]證實(shí)豌豆去頂2.5 h后，糖會(huì)誘使距頂部40 cm處的基部腋芽明顯生長(zhǎng)，鑒于糖類在植物莖中的運(yùn)輸速度可達(dá)150 cm/h，推測(cè)這種快速的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是糖分的作用。此外，人工施加蔗糖2 h內(nèi)會(huì)導(dǎo)致BRC1表達(dá)量下調(diào)。說(shuō)明糖分在調(diào)控植物的分枝發(fā)育中，能夠作為信號(hào)分子起作用。

海藻糖(Trehalose)是廣泛存在于多種有機(jī)體中的一類重要多糖。TPS是海藻糖合成的關(guān)鍵基因，也是腋芽萌發(fā)時(shí)最早響應(yīng)的基因之一[3]。研究表明TPS成員有多個(gè)，雖然有的TPS成員不具有TPS蛋白的催化活性，但缺失后仍能夠引起花序分枝的增多[4], 說(shuō)明TPS蛋白至少部分通過(guò)信號(hào)調(diào)控途徑影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)既是重要的觀賞植物，也是常見(jiàn)的模式植物。因此，本研究以矮牽牛為研究材料，克隆獲得了TPS5同源基因，對(duì)PhTPS5基因的序列以及表達(dá)特性進(jìn)行了分析。該研究不但對(duì)于研究糖分調(diào)控矮牽牛分枝發(fā)育的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，并且對(duì)于培育具有不同分枝特性的矮牽牛新品種具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

該研究以矮牽牛(P.hybrida)為試材。矮牽牛全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)見(jiàn)于Sol Genomics Network(https://solgenomics.net/)。其他物種的TPS蛋白序列來(lái)源于NCBI。

矮牽牛實(shí)生苗種置于智能人工氣候箱中(RTOP-430B)，組培苗放置于組織培間中。溫度均設(shè)置為(23±2)℃，光照強(qiáng)度為3 500 Lx，光周期為16 h/8 h (光/暗)。

1.2 方 法

1.2.1PhTPS5基因全長(zhǎng)序列的克隆以已經(jīng)公布的矮牽牛基因組序列為參考，設(shè)計(jì)上游引物PhTPS5-F(ATGGTTTCGAGGTCATATTCCA-ACT), 下游引物PhTPS5-R (CTATTCTCGGTCA-ATGATTACGCG)。取矮牽牛葉片，使用EZ-10總RNA小量提取試劑盒 (上海生工生物工程有限公司)提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以F/R作為引物，使用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增獲得PhTPS5序列。將克隆獲得的序列經(jīng)加A反應(yīng)后連接到pGEM-Teasy載體, 鑒定陽(yáng)性克隆送由上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2PhTPS5的表達(dá)分析組織特異性表達(dá)實(shí)驗(yàn)：分別取矮牽牛根、莖、葉、花、葉腋等部位。使用EZ-10總RNA小量提取試劑盒提取RNA；去頂及IAA處理實(shí)驗(yàn)：將矮牽牛分為兩組，第一組分別于去除頂端6和24 h后取葉腋部位提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用于基因表達(dá)水平的檢測(cè)。另一組去除頂端的同時(shí)施加10 μL IAA(50 μmol/L)，分別于6和24 h后取下方2～3個(gè)葉腋部位提取RNA，對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；6-BA處理實(shí)驗(yàn)：于自頂端向下的第4個(gè)葉腋處施加10 μL 6-BA(50 μmol/L)，分別于6和24 h后取處理的腋芽提取RNA，用于基因表達(dá)水平的檢測(cè)。每個(gè)處理12棵苗，共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR參照董麗麗等的方法[5]；根據(jù)獲得的PhTPS5的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物PhTPS5-RT-F(TGCCTCACTTTCCCCCGTCG)和PhTPS5-RT-R(TTCTTGCTTTGTTTTTCCTT)。使用Actin作為內(nèi)參基因。

1.2.3數(shù)據(jù)分析利用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Excel繪制柱狀圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 矮牽牛PhTPS5基因全長(zhǎng)的克隆與序列分析

M．DL8000；A．PhTPS5全長(zhǎng)驗(yàn)證產(chǎn)物圖1 PhTPS5基因的擴(kuò)增結(jié)果M．DL8000；A．Full length product of PhTPS5Fig.1 Amplification results of PhTPS5

根據(jù)已經(jīng)公布的腋花矮牽牛(P.axillaris)基因組序列，設(shè)計(jì)引物克隆獲得PhTPS5 cDNA序列。該序列全長(zhǎng)2 595 bp，編碼864個(gè)氨基酸 (圖1)。利用Expasy對(duì)PhTPS5蛋白序列進(jìn)行分析，推測(cè)PhTPS5蛋白的分子式C4363H6825N1173O1289S37，該蛋白中相對(duì)含量較多的氨基酸是10.0% Leu、9.0% Val、7.8% Ser、6.9% Asp、6.4% Glu；總的帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)為115，總的帶正電荷的殘基(Arg+Lys)為98。

2.2 矮牽牛PhTPS5的序列分析

將PhTPS5與煙草、辣椒、番茄的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，序列相似性分別為94.35%、92.94%和92.71% (圖2)。TPS家族蛋白通常含有TPS與TPP結(jié)構(gòu)域。研究表明在大腸桿菌TPS結(jié)構(gòu)域中存在結(jié)合葡萄糖-6-磷酸的OtsA Arg9、Trp40、Tyr76、Trp85、Arg300，以及結(jié)合UDP的Gly22、Aspl30、Hisl54、Arg262、Asp361、Glu369[6]。將PhTPS5與OtsA進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)：OtsA Arg9對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基變?yōu)槔i氨酸 (Val), Gly22變?yōu)榻z氨酸 (Ser)，Arg262變?yōu)樘於彼?Asp)，其他位點(diǎn)沒(méi)有變化。

CaTPS5． 辣椒(XP_016572806)；SlTPS5．番茄(XP_004245918); NaTPS5．煙草(XP_016440934)；OtsA．大腸桿菌(WP_105484222)圖2 PhTPS5與其他物種的TPS5比對(duì)CaTPS5．Capsicum annuum (XP_016572806)； SlTPS5．Solanum lycopersicum(XP_004245918);NaTPS5．Nicotiana tabacum(XP_016440934)；OtsA．Escherichia coli (WP_105484222)Fig.2 Alignment of PhTPS5 with other TPS5s

2.3 PhTPS5基因的表達(dá)分析

利用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)PhTPS5在不同組織中的表達(dá)特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明PhTPS5在矮牽牛的根、莖、葉、葉腋、花中均有表達(dá)。其表達(dá)水平從高到低依次為：根>葉腋>莖>花>葉。根中的表達(dá)量約為莖中的5倍，而葉片中的表達(dá)量約為莖中的1/35 (圖 3)。

2.4 去頂誘導(dǎo)PhTPS5基因的表達(dá)

去頂能夠引起腋芽的萌發(fā)，為研究去頂對(duì)PhTPS5基因的調(diào)控作用，分別在去頂6和24 h后檢測(cè)該基因的表達(dá)水平，結(jié)果(圖4)顯示：去頂6 h后，PhTPS5的表達(dá)水平上升至未去頂?shù)?1倍。去頂24 h后，PhTPS5的表達(dá)水平顯著下降，但仍為未去頂植株中的2倍。生長(zhǎng)素能夠間接抑制腋芽的萌發(fā)，為研究生長(zhǎng)素對(duì)PhTPS5的調(diào)控作用，去頂后迅速于莖截面施加IAA，6 h時(shí)PhTPS5表達(dá)水平約為完整植株中的2.8倍，顯著低于去頂6 h未施加IAA時(shí)的表達(dá)水平。在24 h時(shí)，PhTPS5表達(dá)水平下降至完整植株中的1.46倍，仍然低于去頂24 h未施加IAA時(shí)的表達(dá)水平。

2.5 細(xì)胞分裂素促進(jìn)PhTPS5的表達(dá)

細(xì)胞分裂素能夠通過(guò)調(diào)控下游基因直接促進(jìn)腋芽的萌發(fā)。為研究細(xì)胞分裂素對(duì)PhTPS5的調(diào)控，對(duì)矮牽牛腋芽施加6-BA，分別于6和24 h后對(duì)PhTPS5的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(圖5)表明：6-BA施加6 h后，PhTPS1的表達(dá)水平上調(diào)約8.9倍，而24 h后PhTPS1的表達(dá)水平下降為對(duì)照的7.3倍。

3 討 論

TPS途徑及其功能研究側(cè)重于植物的干旱、高溫、低溫、鹽等逆境脅迫及花期調(diào)控[7-8]。然而，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)海藻糖前體T6P能夠調(diào)控植物的分枝發(fā)育[9-10]。T6P在植物體內(nèi)以微量形式存在，其含量通常低于10 nmol/g鮮重，且不能夠運(yùn)輸，在各個(gè)細(xì)胞中均需從頭合成[11]。根據(jù)目前已有研究，一致認(rèn)為T6P在調(diào)控植物的抗逆、花期、分枝發(fā)育等方面均能夠作為信號(hào)分子起作用[10]。

本研究從矮牽牛中克隆了TPS5的同源基因，該基因編碼864個(gè)氨基酸，與同為茄科的辣椒、番茄、煙草相似性均在92%以上。組織特異性表達(dá)分析顯示，PhTPS5在根中表達(dá)量最高，葉片中最低，這與蘋果中TPS5在花中表達(dá)量最高，莖中表達(dá)量最低的結(jié)果不同[12]。說(shuō)明不同物種中TPS5的表達(dá)特性并不相同。

圖中不同小寫字母表示不同組織在0.05水平存在顯著性差異圖3 矮牽牛不同組織PhTPS5的相對(duì)表達(dá)量The different letters in the figure indicated that there were significant differences in different tissues at the 0.05 levelFig.3 The relative expression of PhTPS5 in different tissues of petunia

圖中小寫字母表示不同處理在0.05水平存在顯著性差異圖4 去頂及生長(zhǎng)素影響促進(jìn)PhTPS5基因的表達(dá)The different letters in the figure indicated that there were significant differences in different treatments at the 0.05 levelFig.4 Decapitation and auxin treatment regulated the expression of PhTPS5

圖5 6-BA促進(jìn)PhTPS5基因的表達(dá)Fig.5 6-BA promoted the expression of PhTPS5

研究表明糖分能夠快速誘導(dǎo)腋芽的萌發(fā)，且去頂后糖分快速地向腋芽集中[2]，說(shuō)明腋芽的萌發(fā)需要糖分的積累。此外，研究表明：有的TPS成員雖不具有TPS蛋白的催化活性，但缺失后仍能夠引起花序分枝的增多[4], 說(shuō)明TPS蛋白至少部分通過(guò)信號(hào)調(diào)控途徑影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，矮牽牛去頂6 h后，PhTPS5表達(dá)量迅速上調(diào)，一方面說(shuō)明去頂能夠誘導(dǎo)局部海藻糖的快速合成以促進(jìn)腋芽的萌發(fā)。另一方面PhTPS5有可能直接作為信號(hào)分子起作用，從而激活下游路徑。在去頂24 h時(shí)，PhTPS5表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明PhTPS5可能主要在激活腋芽萌發(fā)的階段起作用，當(dāng)腋芽進(jìn)入萌發(fā)階段后，海藻糖合成速度下降。而去頂后立即施加IAA，則明顯抑制了PhTPS5表達(dá)量的上調(diào)，說(shuō)明生長(zhǎng)素能夠抑制去頂對(duì)下游TPS途徑的激活。

細(xì)胞分裂素能夠直接促進(jìn)腋芽的萌發(fā)。對(duì)矮牽牛葉腋部位施加6-BA 6 h后,PhTPS5的表達(dá)量迅速上調(diào)，說(shuō)明細(xì)胞分裂素能夠通過(guò)調(diào)控PhTPS5的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)局部海藻糖的快速合成，也可能通過(guò)調(diào)控PhTPS5激活下游路徑以促進(jìn)腋芽的萌發(fā)。在24 h時(shí)PhTPS5的表達(dá)水平逐漸下降，進(jìn)一步說(shuō)明PhTPS5可能主要在腋芽萌發(fā)的早期階段起作用。

為進(jìn)一步確定PhTPS5的調(diào)控機(jī)理，本研究后續(xù)將通過(guò)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)分析PhTPS5的轉(zhuǎn)錄水平與分枝發(fā)育的關(guān)系。本研究為闡明TPS途徑在矮牽牛分枝發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于改善矮牽牛株型提供了基因資源。