響應(yīng)面法優(yōu)化保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝

王偉潔,秦翠麗*,王大紅,2,伍家發(fā)

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽 471023;2.洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽 471023)

乳酸菌在維持腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫力等方面具有重要作用,是食品領(lǐng)域的重要益生菌[1-3]。然而,由于乳酸菌對儲藏環(huán)境條件要求比較高、對人體消化道中胃酸和膽汁耐受性差,造成其產(chǎn)品中菌體易失活,不能有效到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用[4-5]。因此,采取有效措施延長乳酸菌在產(chǎn)品中活菌存活時間、提高其在腸道中耐受性,對其有效發(fā)揮生物活性具有重要意義。乳酸菌微膠囊技術(shù)可以大大降低外界環(huán)境條件對菌體的影響,從而顯著提高菌體的抗逆性[6-7]。內(nèi)源乳化法是一種常用的微膠囊技術(shù),是將壁材、交聯(lián)劑(不溶性鈣鹽)及芯材的混合液分散到油相中,形成油包水(W/O)體系,然后加入酸使鈣離子解離并與壁材反應(yīng)形成凝膠,對芯材進(jìn)行包埋,可以使被包埋的芯材能夠抵抗外界環(huán)境因素的破壞,因操作簡便被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[8-10]。

關(guān)于內(nèi)源乳化法制備乳酸菌微膠囊雖有一些研究[11-14],但將果膠和海藻酸鈉作為復(fù)合壁材與不溶性鈣鹽進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的研究還鮮見報道。果膠作為常用的食品添加劑,具有生產(chǎn)成本低、安全性高且交聯(lián)度好的特點(diǎn)。因此,本試驗以保加利亞乳酸菌(Lactobacillusbulgaricus)為芯材,以海藻酸鈉和果膠為復(fù)合壁材,以碳酸鈣為交聯(lián)劑,采用內(nèi)源乳化法制備保加利亞乳桿菌微膠囊,并通過響應(yīng)面試驗對微膠囊制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,為食品工業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)ND02:河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗室保藏。

1.1.2 試劑

海藻酸鈉(食品級):鄭州盛義宏生物科技有限公司;碳酸鈣(食品級):南京松冠生物科技有限公司;果膠:江蘇銳陽生物科技有限公司;食用油:金龍魚集團(tuán);乳化劑Span-80:南通豐源化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 mL,磷酸氫二鉀2 g,醋酸鈉5 g,檸檬酸銨2 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.2 g,加蒸餾水充分溶解后定容至1 L,115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S型磁力攪拌器:北京北分三普儀器有限公司;TS-100C型恒溫?fù)u床:北京市永光明醫(yī)療器械有限公司;FY-1H-N型真空抽濾器:浙江飛越機(jī)電有限公司;LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1D型超凈工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 保加利亞乳桿菌菌懸液制備

菌株活化:從保藏的斜面上刮取兩環(huán)保加利亞乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中,于37℃靜置培養(yǎng)18～24 h,傳代2～3次,至活菌數(shù)達(dá)1×108CFU/mL。

菌懸液的制備:將活化后的保加利亞乳桿菌按3%(V/V)的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中,于37℃靜置培養(yǎng)16 h,重復(fù)傳代2～3次,6 000 r/min、4℃條件下離心10 min,收集菌體,用體積分?jǐn)?shù)為0.9%的無菌生理鹽水洗滌2次,用無菌生理鹽水配制成一定濃度的菌懸液。

1.3.2 保加利亞乳桿菌微膠囊的制備

將芯材(保加利亞乳桿菌菌懸液)與一定濃度的壁材(海藻酸鈉、果膠)溶液混合均勻;加入CaCO3粉末,混勻;將混合液加入含一定濃度Span-80的食用油中(應(yīng)邊加邊攪拌);再加入200μL冰醋酸,攪拌至微膠囊形成;加入250mL pH 5.5醋酸鹽緩沖液,靜置,使微膠囊沉降到醋酸鹽水溶液底部;去除上部油相,洗滌,收集微膠囊,4℃冰箱保存。

1.3.3 保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的測定

微膠囊崩解液的制備:依次將28.4g磷酸氫二鈉和19.2g檸檬酸溶于蒸餾水中,然后定容至1 L,并調(diào)節(jié)pH值為7.0,于115℃條件下滅菌30 min。

微膠囊包埋率的測定:取1.0 g微膠囊于50 mL微膠囊崩解液中,于37℃、180 r/min振蕩2.5 h,取l mL進(jìn)行平板計數(shù)。微膠囊包埋率計算公式如下:

1.3.4 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優(yōu)化

(1)保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優(yōu)化單因素試驗

以包埋率為評價指標(biāo),分別考察海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)、海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比(5∶1、3∶1、1∶l、1∶3、1∶5)、水相油相體積比(1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9)、碳酸鈣與壁材質(zhì)量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶6、1∶12)、乳化劑Span-80體積分?jǐn)?shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、攪拌速率(200r/min、300 r/min、400 r/min、600 r/min、800 r/min)對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋效果的影響。

(2)保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以包埋率(Y)為響應(yīng)值,選取海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比(B)、水相油相體積比(C)和碳酸鈣與壁材質(zhì)量比(D)4個因素,進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗,確定最優(yōu)的微膠囊制備工藝,設(shè)計因素與水平見表1。

表1 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for Lactobacillus bulgaricus microencapsulation preparation process optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微膠囊包埋率影響結(jié)果見圖1。

圖1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate mass fraction on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖1可知,當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時微膠囊包埋率最高,達(dá)到89.7%。質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜2%時,包埋率隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增大,分析原因可能是當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸加大時,凝膠反應(yīng)化速度逐漸提高,形成的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度逐漸增加,包埋率由79.8%提高至89.7%;當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞2%之后,包埋率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸降低至75.4%,分析原因可能是隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加,反應(yīng)體系的黏度與表面張力開始增大,導(dǎo)致需要包埋的菌體分散困難,從而引起包埋率降低[15]。因此,確定最優(yōu)的海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

2.1.2 海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比對微膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比對微膠囊包埋率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of sodium alginate and pectin on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖2可知,當(dāng)海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比為1∶1時微膠囊包埋率最高,達(dá)到82.4%。當(dāng)質(zhì)量比＞1∶1時,包埋率隨著質(zhì)量比的減小由68.7%提高至82.4%,分析原因可能是當(dāng)質(zhì)量比較小時,海藻酸鈉的含量相對較低,反應(yīng)體系黏度降低,菌體容易分散于壁材中,所以包埋率隨之升高;當(dāng)質(zhì)量比＜1∶1之后,包埋率隨著質(zhì)量比的減小由82.4%降低至72.5%,分析原因可能是當(dāng)質(zhì)量比繼續(xù)減小時,果膠含量相對較高,使形成的微膠囊強(qiáng)度過大,導(dǎo)致被包埋在凝膠中的菌體不易被釋放出來,從而造成包埋率降低。因此,確定海藻酸鈉與果膠的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶1。

2.1.3 水相油相體積比對微膠囊包埋率的影響

水相油相體積比對微膠囊包埋率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 水相油相相體積比對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of the volume ratio of water and oil phase on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖3可知,當(dāng)水相油相體積比為1∶3時微膠囊包埋率最高,達(dá)到89.2%。當(dāng)體積比＞1∶3時,包埋率隨著水油相體積比的降低由75.8%提高至89.2%,分析原因可能是當(dāng)體積比降低時,油相體積充足,壁材和芯材在油相中的分散和乳化反應(yīng)更加充分,微膠囊包埋率隨之提高;但當(dāng)體積比＜1∶3之后,包埋率隨著體積比的減小而逐漸降低,由最大值降低至77.6%,分析原因可能是當(dāng)體積比繼續(xù)降低時,油相體積越來越大,形成的微膠囊顆粒因過于分散而越來越小,難以有效包埋乳酸菌,導(dǎo)致包埋率較低。因此,確定最優(yōu)水相油相體積比為1∶3。

2.1.4 碳酸鈣與壁材質(zhì)量比對微膠囊包埋率的影響

碳酸鈣與壁材質(zhì)量比對微膠囊包埋率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effect of the mass ratio of calcium carbonate and sodium alginate on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖4可知,當(dāng)碳酸鈣與壁材質(zhì)量比為1∶3時微膠囊包埋率最高,為82.4%。當(dāng)質(zhì)量比＞1∶3時,包埋率隨質(zhì)量比減小由68.6%提高至82.4%,分析原因可能是當(dāng)質(zhì)量比減小時,壁材含量較高,鈣離子結(jié)合位點(diǎn)充分,可以大量生成微膠囊,包埋率也隨之提高;但是當(dāng)質(zhì)量比＜1∶3之后,包埋率隨質(zhì)量比的減小而逐漸降低至72.6%,分析原因可能是當(dāng)質(zhì)量比繼續(xù)減小時,體系中與壁材發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的鈣離子相對越來越少,交聯(lián)反應(yīng)有限,無法包埋更多的乳桿菌,導(dǎo)致包埋率降低。因此,確定碳酸鈣與壁材的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶3。

2.1.5 乳化劑體積分?jǐn)?shù)對微膠囊包埋率的影響

乳化劑體積分?jǐn)?shù)對微膠囊包埋率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 乳化劑體積分?jǐn)?shù)對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.5 Effect of emulsifier volume fraction on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖5可知,在乳化劑體積分?jǐn)?shù)為1.5%時微膠囊的包埋率最高,為78.6%。當(dāng)乳化劑體積分?jǐn)?shù)＜1.5%時,微膠囊包埋率隨著乳化劑體積分?jǐn)?shù)的增大而升高,由75.5%升高至78.6%,分析原因可能是因為乳化劑體積分?jǐn)?shù)的增加使反應(yīng)體系的表面張力增大,利于反應(yīng)物分子的擴(kuò)散,易于發(fā)生交聯(lián)反應(yīng);當(dāng)乳化劑體積分?jǐn)?shù)＞1.5%之后,微膠囊包埋率隨著乳化劑體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸降低,分析原因可能是水相和油相界面處乳化劑分子較多,阻礙冰醋酸順利通過,導(dǎo)致碳酸鈣解離困難,從而阻礙碳酸鈣與壁材之間的反應(yīng)[16],導(dǎo)致微膠囊包埋率減小。因此,確定最優(yōu)乳化劑體積分?jǐn)?shù)為1.5%。

2.1.6 攪拌速率對微膠囊包埋率的影響

攪拌速率對微膠囊包埋率的影響結(jié)果見圖6。

圖6 攪拌速率對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.6 Effect of stirring speed on encapsulation efficiency of Lactobacillus bulgaricus microencapsulation

由圖6可知,微膠囊包埋率隨著攪拌速率的增加呈增大趨勢,由72.3%提高至77.1%,分析原因可能是隨著攪拌速率的增大,溶液乳化更加充分,使得包埋率逐步提高。但當(dāng)攪拌速率＞400 r/min之后,微膠囊包埋率增速變緩,分析原因可能是攪拌速率為400 r/min時,已能夠使溶液充分乳化,增加速率對微膠囊包埋效果無明顯影響[17]。因此,確定400 r/min為最優(yōu)攪拌速率。

2.2 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇對包埋率影響較為顯著的因素海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比(B)、水相油相體積比(C)、碳酸鈣與壁材質(zhì)量比(D)為變量,以包埋率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。

利用軟件Expert Design 8.0對表2試驗結(jié)果進(jìn)行分析,得到4個影響因素與包埋率之間的二次回歸方程:

表2 保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiments for Lactobacillus bulgaricus microencapsulation preparation process optimization

表3 回歸模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由表3可知,微膠囊制備工藝的二次模型P=0.017 5＜0.05,說明該模型顯著(P＜0.05),失擬項P=0.054 3＞0.05,不顯著(P＞0.05),說明該模型可信度高,可以用于分析和預(yù)測保加利亞乳桿菌微膠囊制備工藝的優(yōu)化程度。回歸方程各項方差分析結(jié)果表明,4個因素對微膠囊包埋率的影響主次順序為海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比(B)＞碳酸鈣與壁材質(zhì)量比(D)＞水相油相體積比(C)＞海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A),交互項AD、BD、CD對響應(yīng)值影響顯著(P＜0.05),交互項AB、AC、BC對響應(yīng)值影響不顯著(P＞0.05);二次項A2對響應(yīng)值影響極顯著(P＜0.01),B2、C2、D2對響應(yīng)值影響不顯著(P＞0.05)。

2.2.2 模型驗證

通過回歸模型分析,得到保加利亞乳桿菌微膠囊制備的最佳工藝條件:海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.89%,海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比1∶1,水相油相相體積比1∶2.59,碳酸鈣與壁材質(zhì)量比1∶2.12,為方便操作,將以上數(shù)據(jù)修正為:海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比1∶1,水相油相體積比1∶2.5,碳酸鈣與壁材質(zhì)量比1∶2,乳化劑Span-80體積分?jǐn)?shù)1.5%,攪拌速率400 r/min,以此條件進(jìn)行驗證試驗,3次試驗的平均包埋率為91.8%,基本與模型的預(yù)測值92.7%相符。

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化了內(nèi)源乳化法制備保加利亞乳桿菌微膠囊的工藝條件,得到最佳的工藝參數(shù):海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,海藻酸鈉與果膠質(zhì)量比1∶1,碳酸鈣與壁材質(zhì)量比1∶2,水相油相體積比1∶2.5,乳化劑Span-80體積分?jǐn)?shù)1.5%,攪拌速率400 r/min,在此優(yōu)化條件下,微膠囊的包埋率達(dá)到91.8%。本研究優(yōu)化的工藝參數(shù)可為食品工業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)提供參考依據(jù)。