γ射線輻照預(yù)處理玉米秸稈發(fā)酵產(chǎn)乙醇的研究

張 勇,郭棟豪,王克勤,武小芬,齊 慧,鄧 明,陳 亮*

(1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410125;3.湖南大學(xué) 隆平分院,湖南 長(zhǎng)沙 410125)

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年都產(chǎn)生數(shù)量豐富的秸稈生物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì),2016年全國(guó)農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量為8.16億t,其中玉米秸稈的產(chǎn)量最大,占總量的36.88%[1]。目前秸稈綜合利用水平和效率還比較低,主要集中在肥料化、燃料化、飼料化方面。隨著經(jīng)濟(jì)與社會(huì)的發(fā)展,秸稈的傳統(tǒng)利用方式在逐漸萎縮,秸稈資源處于嚴(yán)重相對(duì)過剩狀態(tài),秸稈露天焚燒事件屢見不鮮,給生態(tài)環(huán)境帶來巨大壓力,因此為秸稈利用尋求新的途徑迫在眉睫。

與此同時(shí),在傳統(tǒng)化石能源日益枯竭的背景下,將數(shù)量巨大的秸稈類木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能源越來越引起人們的興趣[2]。很多國(guó)家從20世紀(jì)70年代左右就已經(jīng)開始了以可再生資源作為補(bǔ)充替代能源的研究[3]。預(yù)處理是秸稈等木質(zhì)纖維素?zé)捴粕镔|(zhì)能源的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸之一。有效的預(yù)處理能破壞秸稈的物理化學(xué)結(jié)構(gòu),有助于提高秸稈的轉(zhuǎn)化效率,但同時(shí)增加預(yù)處理工序又會(huì)提高生產(chǎn)成本,還可能因?yàn)轭A(yù)處理過程使用的酸堿化合物而造成環(huán)境污染,因此能否達(dá)到多方面的平衡成為評(píng)價(jià)預(yù)處理方法是否可行的重要依據(jù)。γ射線輻照是一種很有特色木質(zhì)纖維素的預(yù)處理手段,與常見的預(yù)處理方法比較,秸稈在輻照預(yù)處理時(shí)無需水的參與,也不需要添加酸堿等化合物,因此無環(huán)境污染的顧慮,并且輻照處理過程是在常溫下進(jìn)行,因此能耗低,最關(guān)鍵的是經(jīng)過輻照處理后,秸稈的糖化效率可以數(shù)倍的提高[4-5]。但是關(guān)于輻照預(yù)處理木質(zhì)纖維素的研究大多集中在酶解糖化階段[6-7],對(duì)后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)乙醇工藝研究較少。因此,以γ射線輻照為預(yù)處理手段,探討玉米秸稈酶解發(fā)酵產(chǎn)乙醇的一些基本問題,可以為玉米秸稈煉制燃料乙醇提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈:2016年10月采集于湖南省作物研究所試驗(yàn)田。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(china center of industrial culture collection,CICC)31014。

香草酸、丁香酸、香草醛、對(duì)香豆酸(均為色譜純):德國(guó)Sigma公司;甲酸、乙酸、糠醛、對(duì)羥基苯甲酸、4-羥基苯甲醛、無水葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖、乙腈、甲醇、無水乙醇、硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、硼氫化鈉、硫酸、磷酸氫二銨、無水氯化鈣、氫氧化鈣、氫氧化鈉(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酵母粉(生化試劑):廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;纖維素酶(40FPU/mL):Novozymes公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基:硫酸銨2 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、無水硫酸鎂1 g/L、無水氯化鈣0.2 g/L、酵母粉5 g/L;pH≈6(碳源為玉米秸稈)。121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

60Co-γ輻照裝置:湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所;Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC):賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;TG16-Ⅱ臺(tái)式高速離心機(jī):長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;YXQ-LS-50S11壓力蒸汽滅菌器:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HZQ-F100恒溫?fù)u床:常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米秸稈輻照處理

玉米秸稈在60℃條件下烘干,切成5 cm左右的小段,裝入金屬樣品盒,于室溫條件下用60Co-γ射線進(jìn)行輻照預(yù)處理,輻照劑量率為1.25 kGy/h。

1.3.2 玉米秸稈脫毒處理與發(fā)酵

脫毒處理:分別稱取吸收劑量約800 kGy、絕干質(zhì)量為10 g的輻照玉米秸稈粉于250 mL的具塞錐形瓶中,分三組分別加入100 mL去離子水、100mL氫氧化鈣溶液(pH=11)、100 mL 20 mmol/L硼氫化鈉溶液,然后置于恒溫?fù)u床中,37℃、150 r/min條件下處理2 h,結(jié)束后取出過濾。

乙醇發(fā)酵:取100 mL發(fā)酵專用具塞錐形瓶,分別加入1.5 g的上述3種脫毒處理所得樣品濾渣,滅菌后加入27 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,再按20 FPU/g固體加入纖維素酶,最后加入3 mL種子培養(yǎng)液,置于恒溫?fù)u床中,37℃、150 r/min條件下進(jìn)行同步糖化發(fā)酵(simultaneous saccharification and fer mentation,SSF)。

1.3.3 玉米秸稈在不同工藝條件下的乙醇發(fā)酵

玉米秸稈的酶解:向錐形瓶中加入pH 5.0左右的發(fā)酵培養(yǎng)基45 mL和吸收劑量約800 kGy、絕干質(zhì)量為5 g的輻照玉米秸稈粉,置于高壓滅菌鍋中,121℃滅菌20 min,冷卻后按20 FPU/g固體加入纖維素酶。

玉米秸稈的發(fā)酵:同步糖化發(fā)酵,在加入纖維素酶時(shí)同步加入釀酒酵母,發(fā)酵溫度為37℃;分步糖化發(fā)酵(sepa rate hydrolysis and fermentation,SHF)則是在50℃振蕩酶解48 h后再接入釀酒酵母,發(fā)酵溫度為37℃;變溫同步糖化發(fā)酵(nonisothennal simultaneous saccharitlcation and fermentation,NSSF)是在加入纖維素酶時(shí)同步加入釀酒酵母,于37℃條件下發(fā)酵,期間每發(fā)酵12h便將溫度升至42℃保持20 min,之后在37℃條件下繼續(xù)發(fā)酵,如此反復(fù)直至發(fā)酵結(jié)束;半同步糖化發(fā)酵(hemi simultaneous saccharification and fermentation,HSSF)是在50℃條件下酶解12 h后再接入釀酒酵母發(fā)酵,發(fā)酵溫度為37℃。所有發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的酵母接種量均為10%。

1.3.4 測(cè)定方法

木質(zhì)纖維素含量:按照參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行測(cè)定;纖維素酶酶活:按照參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行測(cè)定;單糖、乙醇含量:按照參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行測(cè)定;抑制物含量:按照參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

乙醇轉(zhuǎn)化率按下式計(jì)算:

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻照處理強(qiáng)度對(duì)玉米秸稈化學(xué)及物理性質(zhì)的影響

表1 輻照對(duì)玉米秸稈主要化學(xué)組分的影響Table1 Effect of irradiation on main chemical constituents of corn straw

從表1可以看出,玉米秸稈經(jīng)過輻照后,3種主要化學(xué)組分的含量都不同程度的降低,說明γ射線對(duì)玉米秸稈的3種主要化學(xué)組分都有降解作用,且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),3種組分含量與輻照強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān),說明輻照強(qiáng)度越大,這3種化學(xué)組分降解越嚴(yán)重,孫豐波[12]在用γ射線輻照竹材時(shí)也發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象,本課題組之前在研究γ射線輻照對(duì)水稻秸稈化學(xué)組分時(shí)還發(fā)現(xiàn)輻照在降低水稻秸稈木質(zhì)纖維素含量的同時(shí)會(huì)使秸稈的可溶性糖大幅度提高[13],因此輻照后玉米秸稈纖維素、半纖維素含量的大幅度降低并不意味著糖的大量損失,而可能意味著大分子的纖維素、半纖維素被降解成較低分子量的糖;3種化學(xué)組分對(duì)輻照的敏感程度不一,木質(zhì)素含量變化最小,說明對(duì)輻照最穩(wěn)定,半纖維素含量變化最大,說明最容易被降解,這可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān),木質(zhì)素是由苯環(huán)類化合物組成,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因此難降解,而半纖維素屬于雜多糖,且側(cè)鏈較多,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差,因此容易被降解[14]。

玉米秸稈經(jīng)不同輻照劑量處理后表觀結(jié)構(gòu)的變化情況見圖1。

圖1 輻照對(duì)玉米秸稈表觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of irradiation on apparent structure of corn straw

從圖1可以看出,未經(jīng)輻照的玉米秸稈表觀結(jié)構(gòu)相對(duì)平滑、完整,輻照后的玉米秸稈微觀結(jié)構(gòu)變的粗糙多孔,說明輻照對(duì)玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)有明顯的破壞作用,在水稻、芒草、蘆葦秸稈中發(fā)現(xiàn)過類似現(xiàn)象[13,15-16]。這種疏松多孔結(jié)構(gòu)增加了玉米秸稈的表面積,有利于秸稈生物煉制過程中酶與底物接觸,提高酶解轉(zhuǎn)化效率。

2.2 不同脫毒處理對(duì)輻照玉米秸稈乙醇發(fā)酵的影響

由于預(yù)處理是將木質(zhì)纖維素原有物理化學(xué)結(jié)構(gòu)破壞并重組的過程,因此不可避免的會(huì)生成新化合物,其中就包括抑制發(fā)酵的物質(zhì),并且預(yù)處理方式、原料種類對(duì)抑制物的生成都有影響[17]。經(jīng)過輻照處理的玉米秸稈在水洗、氫氧化鈣和硼氫化鈉脫毒處理后,脫毒濾液中部分抑制物的濃度情況見表2,濾液中抑制物含量越高,則殘?jiān)幸种莆锖吭叫?脫毒處理對(duì)抑制物脫除效果越好。

有機(jī)酸是木質(zhì)纖維輻照處理過程中最常見的副產(chǎn)物,也是一類常見的發(fā)酵抑制物,由表2可知,氫氧化鈣處理對(duì)甲酸的脫除效果最佳,約為水處理的2.5倍;氫氧化鈣和硼氫化鈉對(duì)乙酸脫除效果相當(dāng),都明顯優(yōu)于水處理,對(duì)于其他有機(jī)酸,除對(duì)香豆酸外,3種處理差別不是非常明顯;而對(duì)于另一種強(qiáng)發(fā)酵抑制物糠醛,氫氧化鈣和硼氫化鈉處理的脫除率約為水的2倍,但是3種處理液中糠醛的含量都不高,可能是木質(zhì)纖維素輻照過程中糠醛生成量較少的原因。

表2 不同脫毒處理對(duì)脫除抑制物效果的影響Table2 Effect of different detoxification treatments on detoxification inhibitors effect

圖2 不同脫毒處理對(duì)輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of different detoxification treatments on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由圖2可知,三種脫毒方式處理后發(fā)酵72 h時(shí)乙醇轉(zhuǎn)化率均基本達(dá)到最大值。三種脫毒處理玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率大小順序?yàn)?硼氫化鈉處理(73.6%)＞氫氧化鈣處理(70.8%)＞水洗(66.7%),均顯著高于未脫毒處理玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率(56.0%)(P＜0.05)。因此,脫毒處理對(duì)提高輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率有明顯作用。

2.3 不同發(fā)酵工藝對(duì)輻照玉米秸稈乙醇發(fā)酵影響

圖3 不同發(fā)酵工藝對(duì)輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of different fermentation processes on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由于不同預(yù)處理方法的作用原理及作用效果都不相同,加上不同原料的化學(xué)成分、物理性質(zhì)也不相同,因此可能導(dǎo)致后續(xù)的酶解發(fā)酵工藝可能需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化[18],選擇合適的酶解發(fā)酵工藝是工藝條件優(yōu)化的第一步。由圖3可知,經(jīng)過輻照的玉米秸稈都能發(fā)酵獲得乙醇,并且發(fā)酵24h后乙醇轉(zhuǎn)化率都接近或達(dá)到最大值,發(fā)酵完成時(shí)間和單糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇時(shí)間相當(dāng),發(fā)酵效率比較高,主要原因是秸稈中大分子纖維素和半纖維素在輻照后已經(jīng)被降解成小分子多糖,多糖水解為單糖的速率大大加快;SHF、NSSF、HSSF和SSF的乙醇轉(zhuǎn)化率分別為41.9%、41.9%、39.6%和55.9%,可以看出前3種工藝的乙醇轉(zhuǎn)化率差異不大,而SSF獲得的乙醇轉(zhuǎn)化率較另外3種工藝高,說明對(duì)于玉米秸稈而言,SSF與輻照預(yù)處理的適配性比較好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)射線輻照處理玉米秸稈進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)乙醇研究,發(fā)現(xiàn)γ射線輻照能破壞玉米秸稈物理化學(xué)結(jié)構(gòu),但同時(shí)發(fā)現(xiàn)在輻照后的玉米秸稈中存在甲酸、乙酸、糠醛、對(duì)羥基苯甲酸、四羥基苯甲醛、對(duì)香豆酸等發(fā)酵抑制物,脫毒處理能降低抑制物濃度并顯著提高乙醇轉(zhuǎn)化率(P＜0.05),其中硼氫化鈉脫毒后的玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率最高,為73.6%;初步研究了發(fā)酵工藝與輻照預(yù)處理的適配性,發(fā)現(xiàn)SSF與γ射線輻照預(yù)處理的玉米秸稈適配性最好,該工藝下輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率為55.9%。