長期定位施肥對(duì)中性紫色土硝化作用及氨氧化微生物的影響

趙普生，韓 苗，熊子怡，郭 濤

(西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716)

長期定位肥料試驗(yàn)，可以定向培育土壤質(zhì)量和功能特點(diǎn)顯著不同的農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)，可以用作評(píng)價(jià)不同施肥方式對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的影響[1-2]。合理施用氮肥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高產(chǎn)、高效的基礎(chǔ)，硝化作用是全球氮素循環(huán)的重要中心環(huán)節(jié)，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)中氮平衡起決定性作用，因此對(duì)硝化作用的研究具有重要的農(nóng)學(xué)和環(huán)境意義[3-5]。

硝化作用是主要由微生物介導(dǎo)的反應(yīng)，指在好氧條件下銨態(tài)氮被氧化為硝態(tài)氮的過程，它是由微生物所驅(qū)動(dòng)的，分別由兩類化能自養(yǎng)微生物參與完成：首先是氨氧化微生物(Ammonia-oxidizing microorganisms,AOM)將氨氧化為亞硝態(tài)氮，再由亞硝酸氧化細(xì)菌(NOB)將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮，其中能將氨氧化為亞硝態(tài)氮的氨氧化微生物包括氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)[4]。施肥制度的不同可導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量和活性的不同，繼而影響土壤微生物的功能[6]。氨氧化微生物與硝化細(xì)菌作為硝化過程的主要參與者不可避免地會(huì)受其影響。賀紀(jì)正等[7]利用定量PCR和DGGE相結(jié)合方法，對(duì)我國湖南祁陽旱地長期定位試驗(yàn)點(diǎn)酸性紅壤的研究結(jié)果顯示，長期施肥對(duì)土壤氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌數(shù)量均有顯著影響，且對(duì)AOA的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了巨大影響。Shen等[8]通過研究河南封丘堿性潮土發(fā)現(xiàn)，長期施肥對(duì)土壤AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，而對(duì)AOA數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生影響。長期不同施肥制度下黃土旱塬黑壚土AOA和AOB群落多樣性和豐度也產(chǎn)生了相應(yīng)的變化[9-10]。

已有研究表明土壤的硝化作用與土壤pH值存在著顯著的相關(guān)性[11-12]，而在以往的研究中酸堿度為中性的土壤研究較少。因此以國家紫色土肥力與肥料效益監(jiān)測(cè)基地的中性紫色土為研究對(duì)象，進(jìn)行土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌amoA基因的Real-time PCR分析，比較長期不同定位施肥對(duì)土壤氨氧化潛勢(shì)和硝化強(qiáng)度的影響，以期明確氨氧化微生物功能的變化是否響應(yīng)微生物基因拷貝數(shù)的變化，并分析不同施肥制度對(duì)功能微生物豐度與功能的影響，為三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮素循環(huán)的有效管理、提高肥料利用效率提供重要依據(jù)。這對(duì)于在中性紫色土區(qū)建立長效科學(xué)的施肥制度，改善紫色土的土壤質(zhì)量和實(shí)現(xiàn)土壤可持續(xù)發(fā)展也具有重要的意義。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

國家紫色土土壤肥力與肥料效益監(jiān)測(cè)基地于1991年在重慶市北碚區(qū)建立，迄今已開展了25年連續(xù)定位試驗(yàn)，試驗(yàn)點(diǎn)位于重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)教學(xué)農(nóng)場，試驗(yàn)地地處東經(jīng)106°26′，北緯30°26′，年平均氣溫18.4℃，全年降水1 105.5 mm、日照1 276.7 h，氣候?yàn)閬啛釒Ъ撅L(fēng)氣候。供試土壤為中性紫色水稻土，由侏羅紀(jì)沙溪廟組紫色砂、頁巖的坡積物和殘積物母質(zhì)發(fā)育而成的紫色土(類)、中性紫色土亞類、灰棕紫泥土屬經(jīng)水耕熟化過程而形成。

本研究涉及其中9個(gè)處理：①CK(無肥區(qū))；②N；③NP；④NK；⑤NPK；⑥M；⑦NPK+M；⑧1.5NPK+M；⑨(NPK)Cl+M。M代表豬糞尿，處理8為化肥增量區(qū)，氮、磷、鉀肥用量是其它各處理的1.5倍，處理9為含氯化肥試驗(yàn)區(qū)，氮、鉀肥用氯化銨、氯化鉀；其它各處理氮、鉀肥分別用尿素、硫酸鉀；磷肥用過磷酸鈣。其中每種肥料的施用量為：氮肥150 kg·hm-2；磷肥60 kg·hm-2；鉀肥60 kg·hm-2；有機(jī)肥22.5 t·hm-2，其水分含量為89%，N、P、K養(yǎng)分干基含量分別為0.48%、0.26%和0.77%。試驗(yàn)地采用小麥-水稻輪作，小區(qū)面積120 m2，小區(qū)之間用40 cm深的水泥板隔開，互不滲漏，且能獨(dú)立排灌。

1.2 樣品采集

于2016年10月水稻收割后進(jìn)行田間取樣，用土鉆鉆取0～20 cm的耕作層土樣，混勻，挑去肉眼可見細(xì)根后過2 mm篩，放入-20℃的冰箱保存以備后續(xù)分析。部分放入冰箱于4℃保存，立即進(jìn)行硝化細(xì)菌數(shù)量、氨氧化潛勢(shì)及硝化強(qiáng)度的測(cè)定，另取一部分放于室內(nèi)風(fēng)干供基本理化分析用。供試土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的基本性質(zhì)

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

土壤pH值用酸度計(jì)法[13]，有機(jī)碳用重鉻酸鉀容量法，全氮用半微量凱氏法，全磷用氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法，全鉀用氫氧化鈉堿熔-火焰光度法，有效磷用Olsen法，速效鉀用醋酸銨浸提-火焰光度法[14]。

土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌amoA基因的Real-time PCR分析：稱取0.5 g鮮土，用土壤Fast DNA?SPIN Kit(QBIO gene Inc.,Carlsbad,CA,USA)提取不同處理土壤微生物總DNA，提取過程按試劑盒說明書進(jìn)行。用iQ5(Bio-rad,USA)熒光定量PCR儀，通過SYBR Green法來測(cè)定氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌amoA基因的豐度，amoA基因的擴(kuò)增用SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKara Bio,Otsu,Shiga,Japan)，氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的amoA基因擴(kuò)增引物分別為amoA-1F/amoA-2R、Arch-amoAF/Arch-amoAR[15-17]，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，引物序列及反應(yīng)程序參見表2。Real-time PCR反應(yīng)完成后設(shè)置溶解曲線用以檢驗(yàn)產(chǎn)物的特異性，其程序?yàn)?55～99℃之間，起始模板濃度由 Ct 值確定。數(shù)據(jù)分析采用 iCycler 軟件(version 1.0.1384.0 CR)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值作為縱坐標(biāo)，不同濃度質(zhì)粒的 Ct值作為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。

表2 PCR引物和反應(yīng)程序

硝化細(xì)菌的測(cè)數(shù)采用稀釋頻度法(most probable numble method,MPN法)[19];氨氧化潛勢(shì)的測(cè)定參考Kurola等[20]的方法；硝化強(qiáng)度的測(cè)定采用懸液培養(yǎng)法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2003和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，S-N-K 檢驗(yàn)計(jì)算顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥對(duì)紫色土硝化微生物的影響

2.1.1 不同施肥紫色土氨氧化細(xì)菌與氨氧化古菌豐度分析

Real-time PCR的結(jié)果如表3所示?？梢钥闯觯煌┓侍幚硗寥乐邪毖趸?xì)菌amoA基因拷貝數(shù)變化較大，每克干土拷貝數(shù)(4.46×103～5.41×105)的log值在3.65～5.73之間，單施化肥或化肥與有機(jī)肥配合施用均顯著提高該土壤氨氧化細(xì)菌豐度，1.5NPK+M處理最高，為CK處理的121倍，而單施有機(jī)肥處理土壤氨氧化細(xì)菌豐度與CK處理相比差異不顯著。施用磷肥處理(NP、NPK+M、1.5NPK+M)土壤氨氧化細(xì)菌豐度顯著高于未施磷處理(N、NK、M)，NPK處理也高于未施磷處理，說明磷素營養(yǎng)是影響氨氧化細(xì)菌生長重要的因素之一。(NPK)Cl+M處理土壤氨氧化細(xì)菌豐度對(duì)數(shù)值為5.41，顯著低于NPK+M和1.5NPK+M處理的5.62和5.73，可推測(cè)含氯化肥的施用會(huì)在一定程度上抑制氨氧化細(xì)菌生長。

表3 不同施肥處理對(duì)氨氧化細(xì)菌與氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)的影響(Log) (g-1干土)

注：不同小寫字母分別表示處理間差異達(dá)5%顯著水平。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線用Real-time PCR技術(shù)獲得的不同施肥處理氨氧化古菌aomA基因拷貝數(shù)變化較小，結(jié)果如表3所示。NP處理每克干土aomA基因拷貝數(shù)最高達(dá)1.38×107(Log值為7.14)，(NPK)Cl+M處理每克干土aomA基因拷貝數(shù)最低為1.64×106(Log值為6.21)，除施用NP顯著提高了土壤氨氧化古菌豐度外，其他施肥處理土壤氨氧化古菌aomA基因拷貝數(shù)差異不顯著，說明施肥對(duì)該土壤氨氧化古菌豐度的影響較小。

2.1.2 不同施肥紫色土硝化細(xì)菌數(shù)量的變化

由圖1可知，施肥影響了硝化細(xì)菌的數(shù)量。土壤硝化細(xì)菌數(shù)量變化幅度較大，呈0.39×102～7.28×103個(gè)·g-1干土變化。與CK相比，單施化肥或化肥與有機(jī)肥配合施用均顯著提高該土壤硝化細(xì)菌數(shù)量，以1.5NPK+M處理硝化細(xì)菌數(shù)量最高，達(dá)7.28×103個(gè)·g-1干土,NPK+M處理次之，為2.91×103個(gè)·g-1干土，NP、NK、NPK和N處理之間差異不顯著，但(NPK)Cl+M處理顯著低于以上施肥處理，M處理最低且與CK相比無顯著性差異。

圖1 不同施肥處理土壤硝化細(xì)菌數(shù)量的變化

2.2 不同施肥對(duì)紫色土硝化特征的影響

2.2.1 不同施肥紫色土氨氧化潛勢(shì)的變化

氨氧化(也稱亞硝化)作用是硝化作用的第一個(gè)過程，氨氧化潛勢(shì)也稱硝化速率，可以用來表征土壤氨氧化能力[20]。由圖2可以看出，施肥明顯影響了該土壤氨氧化潛勢(shì)變化，NPK+M處理土壤氨氧化潛勢(shì)最高，為0.310 μg·g-1·h-1干土，其次分別為NPK、NP、M處理，以上處理與CK處理的土壤氨氧化潛勢(shì)0.157 μg·g-1·h-1干土相比，均顯著提高了土壤氨氧化潛勢(shì)，提高量分別為97.5%、82.8%、67.5%、56.7%和41.8%。N和NK對(duì)土壤氨氧化潛勢(shì)無明顯影響，而(NPK)Cl+M顯著降低了土壤氨氧化潛勢(shì)，相較CK降低了81.5%。由此可見，施用磷肥處理土壤氨氧化能力相對(duì)較高，而含氯化肥的施用極大抑制了土壤氨氧化能力，不同施肥處理土壤氨氧化潛勢(shì)與土壤氨氧化細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)(表3)變化較一致。

2.2.2 不同施肥紫色土硝化強(qiáng)度的變化

亞硝酸氧化作用是硝化作用的第二個(gè)過程，亞硝酸氧化細(xì)菌將NH4+-N 氧化成NO3--N 的作用可以用硝化強(qiáng)度表示。由圖2可以看出，不同施肥制度對(duì)土壤硝化作用強(qiáng)度有明顯的影響，硝化強(qiáng)度的變幅在25%～59%之間。與土壤氨氧化潛勢(shì)變化類似，相較于CK處理的土壤硝化強(qiáng)度(32%)，除(NPK)Cl+M處理外，所有施肥處理土壤硝化強(qiáng)度均得到顯著提高。NPK+M處理硝化強(qiáng)度最高，為59%，1.5NPK+M 、M 、NPK、NP處理相接近，在43%～53%，N與NK處理無顯著差異，分別為38%和39%，(NPK)Cl+M顯著降低了土壤硝化強(qiáng)度，為25%。施肥對(duì)土壤硝化強(qiáng)度的影響與土壤硝化細(xì)菌的數(shù)量(圖1)變化不一致。

圖2 不同施肥處理土壤氨氧化潛勢(shì)與硝化強(qiáng)度的變化

3 討論

3.1 不同施肥對(duì)紫色土氨氧化菌amoA基因與硝化細(xì)菌數(shù)的影響

在本試驗(yàn)條件下氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氨氧化細(xì)菌，其比值范圍為6.37～657.72。在每克干土中高達(dá)1.38×108，這一結(jié)果與許多土壤環(huán)境研究中得到氨氧化古菌amoA基因高拷貝數(shù)相一致[22-23]，不過在農(nóng)田土壤中，雖然AOA在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但氨氧化過程卻仍主要由AOB完成[24]。

研究結(jié)果表明，土壤AOB豐度受到了長期不同施肥管理措施的影響。施用氮肥顯著提高了土壤AOB豐度(表1)，這是由于氮肥為AOB提供了直接可利用的氮源[25]，在以往的研究中也得到類似的結(jié)果[10]。同時(shí)，值得注意的是施用磷肥處理土壤AOB均高于對(duì)應(yīng)的不施磷肥處理，在他人研究中也發(fā)現(xiàn)AOB豐度與土壤速效磷呈正相關(guān)[26]，表明磷在一定意義上也促進(jìn)了氮循環(huán)功能微生物的生長[27]。目前關(guān)于磷肥對(duì)土壤功能微生物的影響的研究較少，需要加強(qiáng)此類的研究。(NPK)Cl+M處理土壤AOB豐度顯著低于其他施肥處理，一方面這可能與含氯化肥的施用降低了土壤pH值(表1)有關(guān)，由于AOB適宜生長的酸度范圍為pH值7.0～8.5，一般在pH值小于6.5的環(huán)境中不易生長[28]，基于不同pH值的紫色土的研究也表明，酸性紫色土中AOB和AOA的豐度低于中性和石灰性紫色土[29]；另一方面可能是Cl-本身對(duì)AOB形成了毒害作用所致[30]。

結(jié)果還表明，相對(duì)于對(duì)AOB豐度的影響，長期不同定位施肥對(duì)AOA豐度的影響較小，這可能是本試驗(yàn)研究采用的是中性紫色土，與其他研究中所采用的酸性土或者堿性土有所差別。因此，施肥對(duì)土壤氨氧化微生物豐度的影響非常復(fù)雜，可能與肥料的種類、施肥方式、土壤類型和利用方式等因素有關(guān)[12]。

施肥能顯著提高該土壤硝化細(xì)菌數(shù)量(圖1)。有機(jī)無機(jī)肥配施對(duì)比單施無機(jī)肥顯著增加了土壤硝化細(xì)菌數(shù)量，1.5NPK+M處理硝化細(xì)菌的數(shù)量最高，是由于長期向土壤中投入高量化肥和有機(jī)肥為硝化細(xì)菌提供了更多可利用的無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)以及碳源所致[31]；而單施有機(jī)肥硝化細(xì)菌數(shù)量與長期無肥處理無顯著性差異，源于化能自養(yǎng)型硝化細(xì)菌是硝化反應(yīng)的主要作用者，不利用有機(jī)碳化合物作為碳源和能源，有機(jī)質(zhì)甚至可能會(huì)抑制硝化細(xì)菌生長[31]。(NPK)Cl+M處理硝化細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較低，這可能與土壤pH值有關(guān)，一般認(rèn)為土壤硝化細(xì)菌生長最適pH值范圍在8.5左右，該處理土壤pH值為5.6時(shí)對(duì)土壤硝化細(xì)菌的影響相對(duì)于為硝化細(xì)菌提供營養(yǎng)物質(zhì)這一因素顯得更為突出。

3.2 不同施肥對(duì)紫色土氨氧化潛勢(shì)和硝化強(qiáng)度的影響

硝化作用是由土壤微生物主導(dǎo)的作物氮素營養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，施肥是調(diào)控土壤微生物硝化作用的手段[32]。同施肥對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌豐度的影響類似，氮肥、磷肥均對(duì)土壤氨氧化潛勢(shì)有顯著的提高作用，有機(jī)無機(jī)肥配施顯著提高了土壤氨氧化潛勢(shì)，表明了農(nóng)田土壤中氨氧化過程仍由氨氧化細(xì)菌主導(dǎo)[24,33]。不同施肥處理土壤硝化強(qiáng)度的變化與氨氧化潛勢(shì)變化表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，表明了土壤硝化過程中氨氧化過程是主要的限速步驟[34]。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)長期不同施肥下硝化細(xì)菌數(shù)與土壤氨氧化潛勢(shì)及土壤硝化強(qiáng)度變化并不一致，有研究認(rèn)為硝化細(xì)菌數(shù)量與土壤硝化強(qiáng)度無顯著相關(guān)關(guān)系[35-36]，本試驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果。另外，含氯化肥的施用導(dǎo)致其土壤氨氧化潛勢(shì)與硝化強(qiáng)度顯著低于其它處理，源于長期施用含氯化肥導(dǎo)致土壤酸化，而pH值影響著土壤NH3的存在形態(tài)，低pH值時(shí)氨分子會(huì)轉(zhuǎn)為NH4+，底物濃度的變化影響了氨氧化菌的豐度和多樣性[37]，結(jié)果表現(xiàn)為低pH值抑制了土壤硝化強(qiáng)度[38]。

4 結(jié)論

在水旱輪作體系下的中性紫色土上，相較于對(duì)土壤氨氧化古菌豐度的影響，長期施肥對(duì)土壤中氨氧化細(xì)菌豐度的影響較大，施用氮肥及施用磷肥都顯著提高了氨氧化細(xì)菌的豐度，單施有機(jī)肥對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌豐度沒有顯著影響，而有機(jī)無機(jī)配施則可以顯著改善土壤氨氧化微生物豐度。值得注意的是長期施用含氯肥料顯著抑制了土壤氨氧化潛勢(shì)與硝化強(qiáng)度。長期不同施肥下氨氧化潛勢(shì)與硝化強(qiáng)度的變化較為一致，硝化強(qiáng)度與硝化細(xì)菌數(shù)量的變化不一致，因此不能用硝化細(xì)菌數(shù)量的多少表征紫色土的硝化強(qiáng)度。本研究表明，長期施肥，特別是有機(jī)無機(jī)肥配施能支持更大的土壤的氨氧化微生物群體，從而增加紫色土氨氧化潛勢(shì)與硝化強(qiáng)度，對(duì)研究中性紫色土的氮循環(huán)具有重要意義。