氮添加對(duì)杉木林土壤有機(jī)碳礦化速率及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)溫度敏感性的影響

董清馨,張心昱,*,王輝民,付曉莉,郭志明,陳伏生

1 中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測(cè)與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,北京 100190 3 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省竹子種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330045

由于世界范圍內(nèi)化石燃料燃燒、工業(yè)發(fā)展以及人造氮肥的生產(chǎn)和使用,全球氮循環(huán)大規(guī)模加速,氮沉降顯著增加[1]。在我國(guó)南方熱帶、亞熱帶森林中,大氣氮沉降量已經(jīng)達(dá)到了30—73 kg N hm-2a-1[2]。生態(tài)系統(tǒng)的大氣氮沉降增加可以加速土壤有機(jī)碳礦化、增加養(yǎng)分有效性、促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收,但系統(tǒng)中的氮一旦超過(guò)植物及土壤微生物對(duì)氮的蓄積能力,生態(tài)系統(tǒng)將出現(xiàn)氮飽和的情況,導(dǎo)致土壤硝酸鹽淋溶、土壤的酸化等問(wèn)題[3]。

土壤碳庫(kù)是生態(tài)系統(tǒng)中最大并且最活躍的有機(jī)碳庫(kù)[4],土壤有機(jī)碳礦化是土壤有機(jī)碳在微生物作用下被分解變?yōu)楹?jiǎn)單無(wú)機(jī)化合物并釋放二氧化碳(CO2)的過(guò)程[5],其強(qiáng)弱可用其礦化速率表示(Cmin),可指示土壤有效養(yǎng)分含量的高低。土壤Cmin的溫度敏感性(Q10)是指土壤溫度每升高10℃,土壤有機(jī)碳礦化速率增加的倍數(shù),Q10數(shù)值越大表示溫度敏感性越高[6]。IPCC報(bào)告指出,1880年以來(lái)陸地和海洋表面溫度平均每年增加0.85℃,預(yù)計(jì)到2100年全球溫度將增加4—7℃[7]。在未來(lái)全球氣候變暖的背景下,溫度升高可能會(huì)促進(jìn)碳礦化速率的增加,因此準(zhǔn)確理解土壤碳礦化對(duì)增溫的響應(yīng)具有重要意義[8]。過(guò)量的氮輸入極大地影響了陸地生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)過(guò)程[9]。目前關(guān)于氮添加對(duì)土壤有機(jī)碳礦化速率溫度敏感性研究較多,但結(jié)果有促進(jìn)[10-11],抑制[2, 12-13]。有機(jī)碳礦化速率及溫度敏感性受底物質(zhì)量[14]、微生物群落組成和養(yǎng)分有效性[15]等多種因素的影響,相關(guān)研究結(jié)果尚無(wú)統(tǒng)一定論。

土壤有機(jī)碳礦化過(guò)程是由土壤微生物驅(qū)動(dòng),土壤酶介導(dǎo)完成的[16]。土壤微生物是參與土壤有機(jī)碳礦化和養(yǎng)分循環(huán)的關(guān)鍵要素[17]。土壤中β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)催化纖維素和半纖維素的分解為葡萄糖。水解酶促反應(yīng)遵循米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S]),其中,Vmax是酶促反應(yīng)的最大潛在反應(yīng)速率,表示底物濃度充足時(shí),土壤酶的最大潛在活性；Km是半飽和常數(shù),即1/2Vmax時(shí)的底物濃度,表示酶與底物結(jié)合的親和性的強(qiáng)弱[18]；Vmax/Km是催化效率[19]。關(guān)于酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其溫度敏感性的研究,是近年來(lái)土壤酶學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題[19-22]。目前,氮添加如何影響水解酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)溫度敏感性還不清楚。

我國(guó)杉木(Cunninghamialanceolata)林種植面積已達(dá)911萬(wàn)hm2,分別占中國(guó)和世界的18%和5%[23]。本研究分析氮添加對(duì)杉木林土壤有機(jī)碳礦化及βG動(dòng)力學(xué)參數(shù)溫度敏感性的影響,為氮沉降背景下土壤碳素循環(huán)的生物化學(xué)過(guò)程對(duì)增溫響應(yīng)的模型提供重要參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 樣地概況

研究樣地位于江西省泰和縣石溪林場(chǎng)(26o52′44″N,115o13′04″E,海拔102 m),該站點(diǎn)屬典型的中亞熱帶季風(fēng)氣候[24],年平均氣溫和降水量分別為17.9℃和1471.2 mm[25]。樣地杉木(Cunninghamialanceolata)建于2000年[26]。土壤類型為典型低鹽基濕潤(rùn)弱育土,土壤母質(zhì)為紅色砂巖和泥石風(fēng)化物[27]。樣地未施氮前的土壤容重為1.31 g/cm,pH為4.6,土壤有機(jī)碳(SOC)含量為17.68 g/kg,全氮(TN)含量為1.12 g/kg,全磷(TP)含量為0.1 g/kg[28]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 長(zhǎng)期氮添加控制試驗(yàn)

在2011年11月設(shè)置杉木林樣方,選擇9個(gè)400 m2(20 m × 20 m)的樣方,并且每個(gè)樣方間有10 m的緩沖地帶。按氮添加量的高低設(shè)置3個(gè)處理：對(duì)照(N0),低氮(N1：50 kg N hm-2a-1),高氮(N2：100 kg N hm-2a-1),每種處理3次重復(fù),施用氮肥為NH4NO3。自2012年開(kāi)始施肥,每年4次,其中生長(zhǎng)季(6月、9月)施肥量為全年的30%,非生長(zhǎng)季(3月、12月)施肥量為全年的20%。本研究在2017年9月采用5點(diǎn)混合法采樣。除去地表凋落物層后,用直徑2 cm的土鉆采集0—10 cm土壤樣品,過(guò)2 mm篩,剔除根系殘?bào)w,自封袋密封后用冷藏箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,4℃冰箱保存。

1.2.2 室內(nèi)控溫培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

對(duì)杉木林3個(gè)處理、3個(gè)重復(fù)共9個(gè)樣品進(jìn)行室內(nèi)溫度梯度培養(yǎng),分別設(shè)置10℃、15℃、20℃、25 ℃、30 ℃、35℃、40℃共7個(gè)培養(yǎng)溫度,總計(jì)63個(gè)樣品。

具體步驟為：稱取相當(dāng)于40 g干土重的鮮土,裝入100 mL圓口塑料瓶中,土壤樣品含水量調(diào)節(jié)至60%的田間持水量[29],放入恒溫(20℃)、恒濕(80%)培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)4 d,然后放入上述溫度梯度的培養(yǎng)箱,在恒濕條件下培養(yǎng)7 d。在培養(yǎng)過(guò)程中,采用稱重法給土壤樣品補(bǔ)水,每隔2—3 d補(bǔ)水1次。

1.3 樣品分析

1.3.1 土壤理化性質(zhì)

1.3.2 土壤碳礦化速率及溫度敏感性

在室內(nèi)控溫培養(yǎng)的第1、3、5、7 d,采用實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的室內(nèi)土壤微生物呼吸自動(dòng)連續(xù)測(cè)定裝置[31],測(cè)定Cmin,計(jì)算4次Cmin平均值,Cmin的計(jì)算公式為：

Cmin=C×V×α×β/m

式中,Cmin為土壤有機(jī)碳礦化速率(μg C d-1g-1)；C為在測(cè)試時(shí)間內(nèi)CO2濃度變化的直線斜率；V為管線和培養(yǎng)瓶的總體積(ml)；α為CO2氣體體積轉(zhuǎn)化為質(zhì)量的系數(shù)；β為時(shí)間(s) 轉(zhuǎn)化為天數(shù)(d)的系數(shù)；m為培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)干土質(zhì)量(g)。

土壤有機(jī)碳礦化速率溫度敏感性的計(jì)算公式為：

Cmin=a×ebT

Q10(Cmin)=e10b

式中,T為自記式紐扣溫度計(jì)記錄的土壤溫度(℃)；a表示0℃時(shí)土壤有機(jī)碳礦化速率(μg C d-1g-1)；b為溫度反應(yīng)系數(shù),a和b由土壤有機(jī)碳礦化速率與溫度擬合獲得；Q10(Cmin)為土壤有機(jī)碳礦化的溫度敏感性,即溫度每升高10℃土壤有機(jī)碳礦化速率增加的倍數(shù)[32]。

1.3.3 土壤β-1,4-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)及溫度敏感性

分別取培養(yǎng)后63個(gè)土壤樣品的1 g鮮土于燒杯中,加入125 ml pH=4.5—5的醋酸緩沖液(50 mmol/L),用玻璃棒攪拌,及旋渦振蕩器混勻,制成土壤懸浮液；吸取土壤懸浮液200 μL于96孔微孔板,再加入50 μL的4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucopyranoside)作底物,底物濃度梯度設(shè)置為5、10、20、30、40、60、100和200 μmol/L,在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)孔中加入50 μL濃度為10 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)4-甲基傘形酮(4-MUB,4-methylumbelliferyl)和200 μL的醋酸緩沖液,樣品分析設(shè)置8個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)置空白。所有微孔板在相應(yīng)溫度培養(yǎng)箱黑暗條件下培養(yǎng)4 h。

停止培養(yǎng)后,每個(gè)孔加入10 μL 1mol/L NaOH溶液,過(guò)1 min后,采用微孔板熒光法在360 nm激發(fā)、460 nm下進(jìn)行測(cè)定(SynergyH4, BioTek)[33-34]。

在SigmaPlot 10.0軟件中對(duì)酶活性和底物濃度進(jìn)行米氏方程雙曲線擬合,計(jì)算土壤酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Vmax和Km),計(jì)算公式為：

V=Vmax[S]/(Km+[S])

式中,V為酶促反應(yīng)速率(nmol g-1h-1)；S為底物濃度(μmol/L)；Vmax為酶促反應(yīng)的潛在最大速率(nmol g-1h-1)；Km為半飽和常數(shù)(μmol/L)。

土壤酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)溫度敏感性的計(jì)算公式為：

Q10=eSlope×10

式中,Slope為對(duì)Vmax和Km進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,與培養(yǎng)溫度建立線性回歸方程的斜率[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用協(xié)方差分析(ANCOVA)對(duì)不同氮添加水平和培養(yǎng)溫度下的Cmin和βG動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),氮添加處理作為主影響因子,培養(yǎng)溫度作為協(xié)變量。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)不同處理土壤理化性質(zhì)、土壤Cmin以及βG動(dòng)力學(xué)參數(shù)的溫度敏感性進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),采用Duncan法進(jìn)行多重比較(P=0.05)。2017年9月采樣時(shí)樣地土壤溫度為27 ℃,因此選擇相近的30℃培養(yǎng)下的土壤Cmin、βG動(dòng)力學(xué)參數(shù),30—40℃培養(yǎng)溫度下βG動(dòng)力學(xué)參數(shù)的Q10值和土壤環(huán)境因子,采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析。利用SigmaPlot 10.0軟件作圖。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.2 氮添加對(duì)有機(jī)碳礦化速率及溫度敏感性的影響

在10—40℃培養(yǎng)溫度范圍內(nèi),不同氮添加處理的土壤Cmin隨溫度的增加而呈指數(shù)增加,為N2>N1>N0。協(xié)方差分析結(jié)果表明,氮添加對(duì)Cmin的影響極顯著(P<0.05)。N0、N1、N2的Q10(Cmin)大小分別為1.21、1.20、1.14,但處理間均無(wú)顯著差異(圖1)。

表1 氮添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

每列不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05,n=3),數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；N0(對(duì)照),N1(50 kg N hm-2a-1),N2(100 kg N hm-2a-1)；SOC：Soil Organic Carbon；TN：Total Nitrogen；TP：Total Phosphorus；DOC：Dissolved Organic Carbon；aP：available Phosphorus；C/N：Carbon/Nitrogen；DOC/SOC：Dissolved Organic Carbon/Soil Organic Carbon

圖1 不同氮添加水平土壤有機(jī)碳礦化速率及溫度敏感性Fig.1 Soil organic carbon mineralization rate and their temperature sensitivity under different nitrogen additionsCmin：土壤有機(jī)碳礦化速率,soil organic carbon mineralization rates

2.3 氮添加對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)及溫度敏感性的影響

圖2 不同氮添加水平β-1,4-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)及溫度敏感性Fig.2 Kinetic parameters and their temperature sensitivity of β-1,4-glucosidase under different nitrogen additionsVmax：最大反應(yīng)速率,maximum rates of velocity ；Km：半飽和常數(shù),half-saturation constant ；Vmax/Km:催化效率,catalytic efficiency

不同氮添加水平下的lnVmax、ln(Vmax/Km)與溫度呈顯著正相關(guān),且值大小為N2>N1>N0(P<0.05)。不同氮添加水平的Q10(Vmax)和Q10(Km)的大小都表現(xiàn)N2>N1>N0,并且差異顯著,而不同處理間Q10(Vmax/Km)無(wú)顯著差異(圖2)。

2.4 相關(guān)分析

表230℃土壤有機(jī)碳礦化速率、β-1,4-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和土壤環(huán)境因子的相關(guān)性

Table2Thecorrelationsbetweensoilorganiccarbonmineralizationrate,kineticparametersofβ-1,4-glucosidaseandthesoilenvironmentalfactorsat30℃

參數(shù)ParameterspH有機(jī)碳SOC全氮TN全磷TP可溶性碳DOC銨態(tài)氮NH+4-N硝態(tài)氮NO-3-N有效磷aPCminCmin-0.4310.4380.1040.841??0.195-0.1940.890??0.729?1.000Vmax-0.720?-0.040-0.2570.894??0.404-0.5340.822??0.2750.739?Km-0.010-0.441-0.794?0.0800.195-0.1980.326-0.0960.177Vmax/Km-0.675?0.2850.2770.803??0.224-0.3830.5420.3440.589Q30—40℃10(Vmax)-0.704?-0.596-0.2360.2580.188-0.4220.485-0.4440.129Q30—40℃10(Km)-0.390-0.0280.4300.1090.033-0.1680.115-0.184-0.015Q30—40℃10(Vmax/Km)-0.073-0.440-0.800??0.0780.115-0.1510.273-0.1080.145

3 討論

3.1 氮添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

3.2 氮添加對(duì)土壤有機(jī)碳礦化速率及溫度敏感性的影響

氮添加量越高,土壤Cmin越高,這與Wang[13]、向元彬[41]等研究結(jié)果一致。氮添加增加了土壤有效氮、磷養(yǎng)分含量,促進(jìn)微生物生物量增加[28],并促進(jìn)微生物分泌獲取能量的酶活性,增加土壤有機(jī)碳礦化速率[41]。有機(jī)碳礦化速率除與土壤養(yǎng)分含量有關(guān),還受底物中元素比值的影響[42],較低的C/N表示微生物的有機(jī)碳分解作用更強(qiáng),反之則較弱[43]。但本研究中氮添加對(duì)土壤C/N無(wú)顯著影響表明本研究中C/N不是影響Cmin的主要因子。

土壤有機(jī)碳礦化速率的Q10值隨氮添加量的升高而下降,但處理間差異不顯著。Mo[2]在我國(guó)南方亞熱帶森林的研究也顯示有機(jī)碳礦化速率的Q10值隨氮添加量的升高而顯著下降。Mo認(rèn)為溫度是影響Cmin最主要因素,但大量氮添加改變了溫度對(duì)土壤呼吸速率的控制作用[2]。與之相比,本研究樣地氮添加為7a,而Mo樣地氮添加為15a,相對(duì)較短時(shí)間的氮添加處理可能是導(dǎo)致差異不顯著的原因。Q10(Cmin)受多種因素影響,如有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定性、底物有效性和微生物活性等[44]。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)原理,分子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的底物,即生物化學(xué)上越難分解的有機(jī)質(zhì),其分解所需要的活化能就越高,其Q10值就越高[14]。本研究不同氮添加處理下土壤DOC/SOC無(wú)顯著差異,這也可能是造成不同氮添加處理下的Q10(Cmin)也無(wú)顯著差異的原因之一。

3.3 氮添加對(duì)土壤β-1,4-葡萄糖苷酶活性動(dòng)力學(xué)參數(shù)及溫度敏感性的影響

不同氮添加水平βG的Vmax和Vmax/Km隨溫度升高而增大,這是因?yàn)闇囟壬?酶分子活動(dòng)加劇,βG和底物反應(yīng)速率增大,導(dǎo)致Vmax和Vmax/Km增加[21]。本研究中氮添加導(dǎo)致土壤氮磷含量增加,從而導(dǎo)致微生物能量(碳素)相對(duì)缺乏,根據(jù)微生物分泌酶的經(jīng)濟(jì)性原則[45-47],微生物產(chǎn)生更多與碳分解有關(guān)的酶(如βG),分解土壤中的纖維素、半纖維素等,提高土壤有機(jī)碳分解速率的同時(shí)也增大碳水解酶βG的活性以及酶和底物的催化效率[26],在溫帶森林研究結(jié)果與本研究的結(jié)果一致[15]。土壤酶Vmax和Cmin正相關(guān)表明,未來(lái)氮沉降繼續(xù)增加情景下,氮添加滿足微生物的養(yǎng)分和能量需求,微生物將分泌更多βG水解酶,進(jìn)一步促進(jìn)有機(jī)碳分解。

不同氮添加處理?xiàng)l件下,βG的Km隨溫度增加出現(xiàn)了增加、降低、不相關(guān)3種趨勢(shì)。目前對(duì)于Km隨增溫的變化趨勢(shì)的研究結(jié)果不一致[15, 20],說(shuō)明溫度不是影響酶與底物親和性的唯一因素。N0的lnKm隨溫度線性降低,這是因?yàn)闇囟仍礁?酶與底物活動(dòng)劇烈,結(jié)合更緊密,親和性更高[42]。而N2 的lnKm隨溫度線性升高,表明土壤中可能存在吸附于土壤顆粒上的其他可與酶反應(yīng)的物質(zhì),其溫度升高會(huì)促進(jìn)這些物質(zhì)的解吸附作用,與底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶的活性中心,導(dǎo)致Km增加[15]。

氮添加同時(shí)增加了Vmax和Km的Q10值,導(dǎo)致對(duì)Q10(Vmax/Km)值無(wú)影響。亞熱帶地區(qū)溫度較高,氮添加增加βG的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的Q10值,表明微生物可以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐两翟黾雍驮鰷貤l件。溫帶森林氮添加對(duì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)溫度敏感性的研究顯示,氮添加對(duì)所測(cè)5種酶的Q10(Vmax)無(wú)明顯影響,但顯著增加了木糖苷酶(βX)的Q10(Km)[15]。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的溫度敏感性與土壤環(huán)境、底物有效性等多種因素有關(guān)[18]。本研究施氮量(50、100 kg N hm-2a-1)高于溫帶森林施氮量(25.2、35 kg N hm-2a-1)[15],這可能導(dǎo)致本試驗(yàn)水解酶活性對(duì)溫度更為敏感。而通過(guò)分析30—40℃范圍內(nèi)βG的Q10(Vmax)和Q10(Vmax/Km),發(fā)現(xiàn)前者與pH負(fù)相關(guān),后者與TN正相關(guān),說(shuō)明土壤環(huán)境是影響動(dòng)力學(xué)參數(shù)溫度敏感性的重要因素。

4 結(jié)論

氮添加增加土壤有機(jī)碳礦化速率、β-1,4-葡萄糖苷酶的最大潛在反應(yīng)速率和催化效率,并且高氮處理效果更顯著。氮添加對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應(yīng)速率和半飽和常數(shù)的溫度敏感性有顯著促進(jìn)作用,且高氮處理效果更顯著,但氮添加對(duì)有機(jī)碳礦化速率和β-1,4-葡萄糖苷酶催化效率的溫度敏感性影響不顯著。30℃培養(yǎng)溫度下的數(shù)據(jù)相關(guān)分析表明,土壤有機(jī)碳礦化速率與土壤全磷、硝態(tài)氮、有效磷、β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應(yīng)速率正相關(guān)；β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應(yīng)速率與土壤總磷、硝態(tài)氮含量正相關(guān),與土壤pH負(fù)相關(guān)；半飽和常數(shù)和全氮負(fù)相關(guān)；催化效率和pH負(fù)相關(guān),和全磷正相關(guān)。30—40℃培養(yǎng)溫度下,β-1,4-葡萄糖苷酶最大潛在反應(yīng)速率的溫度敏感性和pH負(fù)相關(guān),催化效率的溫度敏感性和全氮負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果表明,未來(lái)氮沉降加劇和全球變暖情景下,亞熱帶杉木林土壤β-1,4-葡萄糖苷酶活性和催化效率會(huì)持續(xù)增強(qiáng),土壤有機(jī)碳礦化速率會(huì)增加。