白羊草Epichlo?屬內(nèi)生真菌的分離鑒定及其重金屬耐受性

賈 彤,王瑞宏,曹苗文

山西大學(xué)黃土高原研究所,太原 030006

內(nèi)生真菌(endophyte)為“生活在活體植物地上部分的組織中,而不引起宿主植物明顯病害癥狀的真菌”[1]。草本、灌木、針葉樹和藻類等都可成為內(nèi)生真菌的宿主,其中最常見的宿主是禾本科植物。在溫帶天然禾草中,約十分之一植物感染內(nèi)生真菌[2],早熟禾亞科約有30%植物感染內(nèi)生真菌[3-4]。Epichlo?屬內(nèi)生真菌與冷季型禾草共生,全世界至少有30個屬的禾草感染這種內(nèi)生真菌,也是目前研究最為廣泛的內(nèi)生真菌之一[5-6],已命名的與天然禾草共生的Epichlo?屬內(nèi)生真菌共有43種[7]。例如,王志偉等從華東、華北以及西北等地區(qū)的鵝觀草屬(Roegneria)植物中發(fā)現(xiàn)Epichlo?yangzii[8]和Epichlo?sinicum[9]兩種不同的特異性內(nèi)生真菌。李春杰等從醉馬草(Achnatheruminebrians)中得到Epichlo?gansuensis[10]。羽茅(Achnatherumsibiricum)在自然種群中感染的兩種優(yōu)勢菌株為Epichlo?gansuensis和Epichlo?sibirica[11]。朱敏杰等[12]從羊草(Leymuschinensis)中分離得到Epichlo?bromicola內(nèi)生真菌。此前,本課題組已對天然禾草白羊草(Bothriochloaischaemum)中內(nèi)生真菌的分布調(diào)查發(fā)現(xiàn),白羊草中感染的16種內(nèi)生真菌分別為赤霉屬(Gibberella)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)[13],但對白羊草中Epichlo?屬內(nèi)生真菌的研究還未見報道。

關(guān)于內(nèi)生真菌提高栽培禾草的抗生物與非生物脅迫的研究較多,但關(guān)于尾礦區(qū)內(nèi)生真菌感染對天然禾草的重金屬抗性研究還相對較少。微量金屬離子可滿足微生物正常生長,過量則會產(chǎn)生毒害作用。高重金屬環(huán)境中,有些微生物對多種重金屬具有抗性,這些微生物在重金屬污染的生物修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。大多數(shù)抗重金屬微生物的研究集中于根際和非根際土壤微生物,對植物內(nèi)生真菌重金屬抗性的研究報道較少。有研究發(fā)現(xiàn),紫霉屬(Purpureocillium)內(nèi)生真菌可以在銅脅迫條件下促進(jìn)秋茄紅樹林生長[14]。Zhang等[15]研究3種深色有隔內(nèi)生真菌(H93、H125 和 H114)都對Pb和Cd具有耐受性?？涤畹劝l(fā)現(xiàn)接種深色有隔內(nèi)生真菌能改善重金屬 Cd 脅迫下紫莖澤蘭的生長狀態(tài)[16],并且深色有隔內(nèi)生真菌通過調(diào)節(jié)植物激素平衡以及光合作用強(qiáng)度使玉米中Cd含量降低,進(jìn)而促進(jìn)玉米生長[2,17-18]。相對于菌根真菌,內(nèi)生真菌存在于植物的地上部分,同時內(nèi)生真菌感染對宿主植物的生長具有促進(jìn)作用[16],染菌植物可能借助于菌絲本身對重金屬的積累,使宿主具有較高生物量且根系活動加強(qiáng),進(jìn)而在修復(fù)重金屬污染土壤中發(fā)揮作用。內(nèi)生真菌宿主范圍較廣且可分離培養(yǎng),例如青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)以及鐮刀菌(Fusarium)等都是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生菌。Epichlo?屬內(nèi)生真菌也能夠提高寄主禾草對Al[19]、Zn[20]和Cu[21]的耐受性。內(nèi)生真菌還可以影響宿主禾草對Fe、Zn、Cu、Ca和P等礦質(zhì)元素的吸收和運(yùn)輸[19,22]。李川等研究發(fā)現(xiàn),感染內(nèi)生真菌可以提高宿主植物羽茅和高羊茅(Festucaarundinacea)對重金屬鋅的耐受性[18,23]。醉馬草感染的Epichlo?gansuensis內(nèi)生真菌可提高宿主的抗旱性、耐鹽性[24]、和對重金屬脅迫的耐受性[25-26]。

白羊草為禾本科孔穎草屬多年生牧草,屬于喜溫性中旱生植物[27],屬于根莖疏叢型下繁禾草,具有短根莖、根系發(fā)達(dá)、分蘗能力強(qiáng)、能形成大量基生葉叢的特點(diǎn)[28]。葉片無毛或少毛,莖頂著生有4～多數(shù)總狀花序,穎果,具有有性及無性繁殖能力,壽命長達(dá)10年以上。適口性強(qiáng),是一種優(yōu)良水土保持型的牧草資源。白羊草群落是我國暖溫帶森林草原區(qū)有代表性的植被類型,也是落葉闊葉林區(qū)森林破壞后出現(xiàn)的次生植被類型[29],白羊草廣泛分布于黃土高原東南部和南部的低山丘陵、梁峁頂部的溫暖帶地段[30]。本實(shí)驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)描述和分子鑒定的方法,對銅尾礦庫白羊草內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定,探究與白羊草共生的Epichlo?屬內(nèi)生真菌特點(diǎn),并通過對內(nèi)生真菌進(jìn)行不同重金屬脅迫處理,探究與白羊草共生的Epichlo?屬內(nèi)生真菌重金屬耐受性潛力,這為豐富禾草內(nèi)生真菌資源,以及內(nèi)生真菌資源在重金屬污染土壤修復(fù)中發(fā)揮作用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究試驗(yàn)樣地位于山西省垣曲縣,該地年均氣溫13.5℃,年均降水量631 mm。北方銅業(yè)銅礦峪礦十八河尾礦壩,溝口筑壩,壩體呈梯形。始建于1969年,初期壩高23.0 m,壩頂高程509.0 m。現(xiàn)已筑 14級子壩,壩頂高程564.2—570.8 m,平均壩高43.0 m,壩頂長度1714.8 m[31]。尾礦庫壩體為人工堆積,將庫區(qū)近壩體礦砂推至壩前,通過碾壓處理將其壓實(shí)形成壩體,其成分主要為尾礦土、尾礦砂和人工覆蓋的黃土。各個子壩植物群落以白羊草為優(yōu)勢種。2015年7月,自上而下共設(shè)置9個不同恢復(fù)年限的樣地,在每個樣地采集白羊草30株。將白羊草帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離與鑒定,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同子壩白羊草內(nèi)生真菌為赤霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬(Penicillium)[13]以及Epichlo?屬。通過用強(qiáng)氧化物對白羊草地上部分進(jìn)行消解,再將消解產(chǎn)物用等離子體發(fā)射光譜儀(iCAP 6000, Thermo Fisher, UK)測定其重金屬含量[32]。重金屬進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)As含量為0.46 mg/L,Cd含量為3.07 mg/L,Cr含量為658.55 mg/L,Cu含量為153.29 mg/L,Pb含量為194.82 mg/L,Zn含量為62.35 mg/L。

1.2 內(nèi)生真菌分離及孢子觀察

首先進(jìn)行植物表面滅菌,將白羊草葉鞘剪成約1 cm的小段,放入70%的酒精中5 s,再用5%的次氯酸鈉浸泡7 min,在浸泡過程中不斷搖晃,倒掉次氯酸鈉加入無菌水,用無菌水清洗至少3次,每次30 s。將表面滅菌后的莖段橫放或插入配制好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar,PDA)中,置于25℃培養(yǎng)[12]。待真菌從培養(yǎng)基上長出來后,對單一菌落進(jìn)行純化,純化4代后,菌落形態(tài)保持世代不變后進(jìn)行孢子形態(tài)觀察。將無菌水滴在載玻片上,挑取菌絲置于載玻片上,蓋上蓋玻片用數(shù)碼成像顯微系統(tǒng)(Moticam Pro 205A,Motic,Germany)觀察[9]。

1.3 內(nèi)生真菌的分子鑒定

內(nèi)生真菌DNA提取[8]：提出來的DNA用多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200Pro NanoQuant,TECAN,Austria)測定其濃度和純度,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果[13]。PCR反應(yīng)：將提出來的DNA稀釋至10 ng/μL,選用引物見表1[5]。act反應(yīng)體系50 μL,含有：Template 10 μL,act-F、act-R 各1.0 μL(10μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30 μL。根據(jù)曹苗文等所設(shè)置的條件進(jìn)行調(diào)整[13],下同,反應(yīng)條件為：94℃,9 min;94℃,1 min;52℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40個循環(huán);Tub反應(yīng)體系50 μL,含有：Template 10 μL,Tub-F、Tub-R 各0.8 μL(10 μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30.4 μL。反應(yīng)條件：94℃,9 min;94℃,1 min;54℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40個循環(huán);tef反應(yīng)體系50 μL,含有：Template 10 μL,tef-F、tef-R 各1.0 μL(10 μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30 μL。反應(yīng)條件：94℃,9 min;94℃,1 min;60℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40個循環(huán)[7- 8]。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定PCR結(jié)果,選擇最佳PCR產(chǎn)物送至華大基因有限公司測序。

表1 用于tubB、tefA 和actG PCR 擴(kuò)增的引物

1.4 重金屬脅迫處理

向YM液體培養(yǎng)基(每1 L蒸餾水中有麥芽糖3 g,酵母粉3 g,蛋白胨5 g和葡萄糖10 g)中加入不同濃度的重金屬溶液,基于前期對銅尾礦壩土壤及白羊草葉片和根重金屬的背景調(diào)查,分別利用ZnSO4,CuSO4,PbSO4,CdCl2母液設(shè)置重金屬脅迫梯度為Zn2+(0、20、40、60、80、120 mg/L),Cu2+(0、20、40、80、120、160 mg/L),Pb2+(0、60、120、180、240、300 mg/L),Cd2+(0、2、4、6、8 mg/L),每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。無菌條件下,從活化后的內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)基上吸取350 μL菌懸液于YM培養(yǎng)基中,將其放置到恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY- 200D)中培養(yǎng)(200 rpm,25℃),根據(jù)白羊草內(nèi)生真菌生長曲線的結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)將內(nèi)生真菌生長的測定時間確定為15天。培養(yǎng)結(jié)束后,用滅菌濾紙過濾收集內(nèi)生真菌,放入烘箱65℃烘干稱重,計算菌絲生長量。菌絲體干重的計算：過濾菌液前將濾紙標(biāo)號并稱重,在烘箱中至恒重后用電子天平稱濾紙干重,烘干后濾紙的干重與過濾前濾紙差值即為菌絲體干重。

1.5 分子系統(tǒng)學(xué)分析

對于序列數(shù)據(jù),首先把測序結(jié)果前端和后端的雜峰序列去除,然后在National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對。先使用MEGA6校準(zhǔn),然后去除比對序列兩端多余的部分,使序列等長,然后運(yùn)用最大似然法(Maximum-Likelihood法)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,制作系統(tǒng)進(jìn)化樹,同時計算遺傳距離。

1.6 統(tǒng)計分析

不同重金屬脅迫下內(nèi)生真菌生長量的均值比較采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析,并進(jìn)行Duncan顯著性檢驗(yàn),結(jié)果采用SigmaPlot 12.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白羊草內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)特征

菌落在25℃、PDA培養(yǎng)基上生長4周的直徑為23.2—39.1 mm。菌落白色、棉質(zhì)、緊實(shí)、在培養(yǎng)基表面突出、無回旋或呈輕微回旋狀;氣生菌絲透明、豐富、光滑;菌落背面淺黃色。培養(yǎng)條件下孢子豐富,產(chǎn)孢細(xì)胞在氣生菌絲上側(cè)向生長,分生孢子透明,橢圓形或腎形,大小為1.2—8.0 μm(圖1,表2)。

圖1 白羊草中Epichlo? sibiria的菌落(a)和分生孢子形態(tài)(b,c)Fig.1 Colony(a) and conidia(b,c) of Epichlo? sp. isolated from B. ischaemum照片拍攝于菌株(Epichlo? sp.)在PDA培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3周后。左：標(biāo)尺= 1 mm;中：標(biāo)尺=10 為μm

編號Number孢子大小/μmSpore size生長速率Growth rate/(mm/周)編號Number孢子大小/μmSpore size生長速率Growth rate/(mm/周)Epichlo? sp.01(1.208—3.642) × (1.703—3.642)8.248±1.011Epichlo? sp.05(2.036—3.115) × (2.036—5.260)9.788±2.432Epichlo? sp.02(3.025—3.025) × (3.025—5.122)6.239±0.164Epichlo? sp.06(2.067—4.931) × (2.067—7.718)8.248±1.835Epichlo? sp.03(1.876—2.626) × (1.876—5.281)7.180±0.204Epichlo? sp.07(1.360—3.054) × (1.360—6.773)6.332±0.166Epichlo? sp.04(1.997—4.188) × (1.997—8.048)5.810±0.120

2.2 白羊草內(nèi)生真菌部分Epichlo? sp.菌株tubB、tefA 和actG 擴(kuò)增結(jié)果

用Moon 等[23,25]設(shè)計的引物(表1),分別對白羊草內(nèi)生真菌actG、tefA和tubB進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示：3 對引物在所有菌株的actG、tefA和tubB擴(kuò)增中,都得到了清晰的片段,大小分別為1600 bp, 800 bp和940 bp左右(圖2)。

圖2 部分白羊草內(nèi)生真菌actG、tefA 和tubB擴(kuò)增結(jié)果 Fig.2 Some PCR products of actG, tefA and tubB from endophytes associated with B. ischaemum

2.3 白羊草內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育分析

從不同白羊草葉鞘中分離得到的內(nèi)生真菌在菌落形態(tài)和生長速度上都具有典型的Epichlo?屬內(nèi)生真菌的特征 (圖1)。將白羊草葉鞘分離出的內(nèi)生真菌對actG,tubB和tefA 片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序,將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些內(nèi)生真菌與Epichlo?屬菌相似性達(dá)到97%以上。將這些菌株序列與白羊草內(nèi)生真菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從actG系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,白羊草內(nèi)生真菌與羽茅和醉馬草中的E.gansuensis和羽茅中的E.sibirica相似可能性較大(圖3);從tefA系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果可知,白羊草內(nèi)生真菌與E.sinicum系統(tǒng)發(fā)育距離最近,其次為E.chisosum,而與E.gansuensis和E.bromicola形成了一個亞枝(圖4)。tubB的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,白羊草內(nèi)生真菌首先與鵝觀草屬植物中E.sinicum聚合在一起,然后與來自日本兩種冰草屬(Agropyronciliare和Agropyrontsukushiense)菌株形成一亞枝(圖5)。

圖3 根據(jù)actG序列,使用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of actG sequences進(jìn)化枝上顯示的數(shù)字(≥50%)表示1000 次自展檢驗(yàn)后的置信度

圖4 根據(jù)tefA序列,使用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of tefA sequences進(jìn)化枝上顯示的數(shù)字(≥50%)表示1000 次自展檢驗(yàn)后的置信度

圖5 根據(jù)tubB序列,使用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of tubB sequences進(jìn)化枝上顯示的數(shù)字(≥50%)表示1000 次自展檢驗(yàn)后的置信度

2.4 白羊草內(nèi)生真菌對重金屬的耐受性

由圖可知,隨著Zn2+濃度的增加,內(nèi)生真菌干重呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,在Zn2+濃度為20 mg/L是內(nèi)生真菌干重達(dá)到最低值為0.12 g,在濃度為80 mg/L,干重達(dá)到最大值為0.28 g(圖6)。隨著Cu2+濃度升高,內(nèi)生真菌干重呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,Cu2+濃度為40 mg/L時,內(nèi)生真菌干重達(dá)到最大,且顯著高于對照組。濃度從40 mg/L到120 mg/L時菌絲干重緩慢降低(圖6)。Epichlo?屬內(nèi)生真菌對Pb2+脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)為,當(dāng)Pb2+為240 mg/L,菌絲干重達(dá)到最大值,并且顯著高于其他各濃度下菌絲重量(圖6)。對于Cd2+脅迫而言,各個梯度下內(nèi)生真菌干重均無顯著差異(圖6)。

圖6 不同重金屬脅迫下白羊草內(nèi)生真菌的菌絲干重Fig.6 The dry weight of Bothriochloa ischaemum endophytes under different heavy metal stresses

3 討論

本研究首次從白羊草中檢測并分離得到Epichlo?屬內(nèi)生真菌。tubB和tefA序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明,白羊草內(nèi)生真菌與來自羽茅的E.sibiria非常相似,支持率分別達(dá)99%和98%,與冰草屬禾草上的Epichlo? 菌株以及雀麥屬(Bromus)禾草上分離到的E.bromicola相似可能性較大,進(jìn)化樹上自展率為94%。在通過actG基因序列得到的ML系統(tǒng)發(fā)育樹中,白羊草內(nèi)生真菌與來自羽茅上的E.sibiria和E.gansuensis菌株相似性較高,支持率分別達(dá)99%和100%,但白羊草內(nèi)生真菌的形態(tài)特征與羽茅中E.gansuensis不盡一致,具體表現(xiàn)為：從羽茅中分離純化的內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上生長速度快,并且菌落表面更加光滑和致密[11-12],而本研究中,白羊草內(nèi)生真菌生長速度緩慢,并且與羽茅中E.sibiria內(nèi)生真菌的特征描述相似。通過形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,將白羊草內(nèi)生真菌鑒定為Epichlo?sibiria。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同恢復(fù)年限分離得到的白羊草內(nèi)生真菌分別為赤霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬[13]以及Epichlo?屬。把白羊草內(nèi)生真菌與已知吸附重金屬的內(nèi)生真菌做系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)Epichlo?屬和白腐菌有較近的親緣關(guān)系,白腐菌對鎘有良好的吸附作用,白羊草能夠生活在鎘污染土壤的植物體內(nèi),可能由于Epichlo?sibiria對鎘也有吸附作用。分子鑒定結(jié)果揭示與白羊草共生的內(nèi)生真菌特點(diǎn),為今后研究白羊草-內(nèi)生真菌共生體的生理生態(tài)特征提供科學(xué)基礎(chǔ)。

Vivas 等在鋅污染的土壤中篩選到抗100 mg/L Zn2+的短芽孢桿菌屬(Brevibacillus),羽茅內(nèi)生真菌在Zn2+脅迫下的半致死濃度為80 mg/L[35],與已報道的細(xì)菌和內(nèi)生真菌的重金屬抗性相比,本研究中白羊草內(nèi)生真菌在120 mg/L的Zn2+脅迫處理下能繼續(xù)生長,說明白E.sibiria內(nèi)生真菌自身對Zn2+具有較高抗性。Wu 等在鉛鋅尾礦土中篩選到對100 mg/L Cu2+和300 mg/L Pb2+都有較強(qiáng)抗性的固氮菌屬和芽孢桿菌,本試驗(yàn)中銅尾礦壩白羊草E.sibiria內(nèi)生真菌表現(xiàn)出對240 mg/L Pb2+和160 mg/L Cu2+都有一定抗性,這可能是由于植物內(nèi)生真菌專性寄生于宿主體內(nèi),長期以來形成密切的共生關(guān)系,與細(xì)菌相比,真菌呈絲狀生長且生長快,生物量大,因而抗重金屬能力優(yōu)于內(nèi)生細(xì)菌[36]。已有研究發(fā)現(xiàn),高羊茅內(nèi)生真菌和羽茅內(nèi)生真菌對Cd2+脅迫的耐受濃度分別為1 mg/L和5 mg/L[35],而白羊草內(nèi)生真菌對Cd2+脅迫的耐受濃度為8 mg/L。本研究中分離純化得到的銅尾礦壩白羊草E.sibiria內(nèi)生真菌,對重金屬Zn2+、Cu2+、Pb2+和Cd2+具有較高水平的抗性。這可能是內(nèi)生真菌通過表面的吸附作用,或是菌絲分泌出多糖物質(zhì)的結(jié)合作用使重金屬的毒性降低[37]。因此,白羊草內(nèi)生真菌在多種重金屬污染的土壤修復(fù)過程中可能會有更大的適用性,特別是在銅礦區(qū)生態(tài)修復(fù)過程中,白羊草內(nèi)生真菌可能對提高宿主抗性方面具有一定潛力。

4 結(jié)論

利用PDA培養(yǎng)基分離的方法,從白羊草中分離出的菌株菌落正面呈白色,背面淺黃色。菌落質(zhì)地致密,形狀為中間突出。生長速度較慢,位于5.810—9.788 mm/周之間,孢子大小為1.208—8.048 μm之間,孢子形態(tài)橢圓、球型。通過進(jìn)行actG、tefA和tubB擴(kuò)增、測序和系統(tǒng)發(fā)育分析 將白羊草內(nèi)生真菌鑒定為Epichlo?sibiria。銅尾礦壩白羊草E.sibiria內(nèi)生真菌對重金屬Zn2+(120 mg/L)、Cu2+(160 mg/L)、Pb2+(240 mg/L)和Cd2+(8 mg/L)具有耐受性。