豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒GP5蛋白的原核表達(dá)

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

0 引言

PRRSV屬于套式病毒目(Nidovirales)，動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)， 動(dòng)脈炎病毒屬，是帶囊膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒[1]。ORF基因編碼病毒的N端糖基化囊膜蛋白(GP5蛋白)，是重要的結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護(hù)性抗原蛋白，參與細(xì)胞免疫與體液免疫[2]。

1 材料與方法

1.1 豬PRRSV GP5蛋白基因的優(yōu)化和合成

根據(jù)Genbank中的豬PRRSV ATCC VR-2332株的GP5蛋白的序列，去除其31個(gè)AA的信號(hào)肽后，對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在序列兩端加入BamH I和Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，優(yōu)化后的序列交由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2 pCold-GP5重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系為：10XFD FastDigest buffer 5 μL，BamH I 2.5 μL，Sal I 2.5 μL，重組質(zhì)粒40 μL。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 重組BL21的構(gòu)建及鑒定

取2 μL 重組質(zhì)粒pCold-GP5加入到100 μL的BL21，冰浴20 min，42℃熱激90 s;冰浴3 min，加入500 μL LB培養(yǎng)基，37℃孵育30 min后，取100 μL涂布到含有Amp的LB平板，37℃，過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆，進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 重組GP5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

誘導(dǎo)的菌液4 000 rpm離心10 min，用50 mL緩沖液(100 mM Tis-Hcl， 50 mM NaCl)重懸菌體，超聲破碎菌體，12 000 rpm離心30 min，收集上清，0.22 μm 濾膜過濾，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pCold-GP5的鑒定

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pCold-GP5，經(jīng) BamH I 和Sal I 雙酶切后， 1%瓊脂糖凝膠電泳，圖 1顯示酶切片段約為522 bp，與預(yù)計(jì)大小相符。

圖1 重組質(zhì)粒pCold-GP5的雙酶切鑒定

2.2 重組BL21的鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳如圖2，在500 bp與750 bp之間有單一條帶，與522 bp的GP5蛋白基因大小符合，說明挑選的重組BL21單菌落含有GP5蛋白基因。

圖2 重組BL21的PCR鑒定

2.3 重組GP5蛋白的鑒定

結(jié)果如圖3所示，19kD處有一明顯條帶，與預(yù)期大小一致。SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果證明， GP5蛋白表達(dá)成功。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS電泳和Western blotting結(jié)果

3 討論

稀有密碼子會(huì)降低目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，合適的密碼子替換可以提高外源基因在宿主中的表達(dá)量[7]。

本研究為了提高GP5蛋白的產(chǎn)量，將GP5基因序列的密碼子優(yōu)化為大腸桿菌偏愛的密碼子，構(gòu)建了重組BL21菌株，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western bloting驗(yàn)證，成功獲得了重組GP5蛋白。