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    一款膠囊產(chǎn)品提高機體免疫活性及抗腫瘤功能活性研究

    2018-11-02 05:28:18李德靈
    中國食品工業(yè) 2018年6期
    關鍵詞:光密度培養(yǎng)液陰性

    李德靈

    無限極(中國)有限公司

    1.前言

    近年來,我國工業(yè)化進程的加速,環(huán)境污染加劇以及快速的生活節(jié)奏和與日俱增的生存壓力,導致各種慢性疾病的患病率越來越高。以癌癥為例,2017年的癌癥統(tǒng)計資料顯示,在中國,每年新發(fā)癌癥病例達 429 萬,占全球新發(fā)病例的 20% ,死亡 281 萬例[1]。癌癥防治已成為我國重要公共衛(wèi)生問題。其實,癌癥的發(fā)病也是由于人體免疫力下降導致[2]。提高人體免疫能力是抗癌的關鍵[2]。

    我國許多中草藥具有提高免疫功能,比如靈芝、薏苡仁、茯苓、白術、菟絲子、黃精、麥冬、甘草和枸杞子等等[3]。市面上有很多提高免疫功能的保健品用其中一種或幾種原料制成產(chǎn)品。本實驗用的膠囊產(chǎn)品以靈芝、薏苡仁、茯苓、白術、菟絲子、黃精、麥冬、甘草、枸杞子中藥材等精制而成。這種復合產(chǎn)品是具具有提高免疫并具有抗腫瘤作用,未見報道。

    本實驗擬采用動物實驗對這一產(chǎn)品的促進免疫功能及抗腫瘤功能進行研究。

    2.實驗材料與試劑

    一款膠囊產(chǎn)品由無限極(中國)有限公司提供。實驗動物來自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。脫纖維綿羊血、Hank's液、ConA 液、RPMI1640培養(yǎng)液、MTT、綿羊紅細胞、脫酸脫氫酶基質(zhì)液和S180細胞株,來自廣州齊云生物科技有限公司;異丙醇、Na2CO3、冰醋酸、臺酚藍、NP40和Triton來自廣州化學試劑廠。

    3.實驗方法

    3.1 增強免疫功能實驗[4]

    3.1.1實驗動物、劑量分組及受試樣品給予時間

    取SPF級ICR小鼠252只,雌性,體重18~22 g,分成3批進行試驗,分別進行DTH和血清溶血素實驗,碳粒廓清實驗,小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗和NK細胞活性測定實驗。每批小鼠均分成5組,每組12只,分別為:陰性對照組,模型對照組,樣品低、中、高劑量組(150,300,600mg/kg)。適應性喂養(yǎng)3天后正式試驗,連續(xù)給藥30 d,經(jīng)口灌胃給予小鼠受試物。

    3.1.2 遲發(fā)型變態(tài)反應

    取新鮮的脫纖維羊血,生理鹽水洗滌3次(1000 rpm,10 min),每只小鼠腹腔注射2%壓積綿羊紅細胞(SRBC)0.2 mL,致敏后4 d,測量左后小鼠足趾厚度,同一部位測量三次,取平均值。然后在測量部位用20 μL 20%的SRBC進行第二次免疫,24 h后測量相同部位厚度,計算二次免疫前后足趾厚度差值。

    3.1.3 ConA 誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

    無菌取脾,置于盛有適量(3-5ml)無菌Hank's液平皿中,并在脾上面放置一塊紗布,用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,用Hank's液洗2次,每次離心10 min(1000 r/min)。然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中,用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞,或用臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95%以上),調(diào)整細胞濃度為3×106個/mL。

    將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,一孔加75 μl ConA 液(相當于7.5μg/mL),另一孔作為對照,置5%CO2,37℃孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔輕輕吸去上清液0.7mL,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,同時加入MTT(5mg/mL)50 μl /孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入1mL酸性異丙醇,超聲震蕩(2秒)或人工吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中,每個孔分裝3孔作為平行樣,用酶聯(lián)免疫檢測儀,以570 nm波長測定光密度值。也可將溶解液直接移入2 mL比色杯中,分光光度計上在波長570 nm測定OD值。

    用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力,受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值,可判定該項實驗結(jié)果陽性。

    3.1.4 血清溶血素抗體積數(shù)的測定

    試驗第26-27天,將壓積綿羊紅細胞(Sheep red blood cells, SRBC)用生理鹽水配成2%(v/v)的細胞懸液,每只鼠腹腔注射0.2 mL進行免疫。第31天后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約1h,3000 r/min離心10 min,收集血清。取U型底的96孔板每孔加入100 μL PBS緩沖液,然后在第一孔加入100 μL小鼠血清吹打均勻,再從第一孔取100 μL到第二孔吹打均勻,再從第二孔取100 μL到第三孔吹打均勻,以此類推進行2倍稀釋,最后一孔取出100 μL棄去,每孔加入100 μL 0.5%(v/v)的SRBC懸液(SA稀釋),混勻,放入生化培養(yǎng)箱37℃溫箱孵育3 h,觀察血球凝集程度,計算抗體積數(shù)。

    3.1.5 碳粒廓清實驗

    所有小鼠通過尾靜脈注射0.2 mL稀釋印度墨汁,計時2、10 min,分別取小鼠內(nèi)眥靜脈血20 μL加入到2 mL0.1%Na2CO3溶液防止發(fā)生凝集。以0.1%Na2CO3溶液作空白對照,在600 nm波長處測OD值。t1表示2 min,t2表示10 min,OD1表示2 min所取靜脈血的光密度值,OD2表示10 min所取靜脈血的光密度值。頸椎脫臼處死小鼠,解剖,取肝臟和脾臟稱重記錄,按下式計算吞噬指數(shù)a。

    3.1.6 NK細胞活性測定: 乳酸脫氫酶測定法

    實驗前24 h將靶細胞進行傳代培養(yǎng)。應用前以Hank's液洗3次,用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL。

    無菌取脾,置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中,并在脾上面放置一塊紗布,用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,用Hank's液洗2次,每次離心10 min(1000r/min)。棄上清將細胞漿彈起,加入0.5 mL滅菌水20秒,裂解紅細胞后再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液,1000 rpm,10 min離心,然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中,用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞;或用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸,用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)(活細胞數(shù)應在95%以上),用臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95%以上),最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL。

    取靶細胞和效應細胞各100μl(效靶比50:1),加入U型96孔培養(yǎng)板中;靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100μl,靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40或2.5% Triton各100μl ;上述各項均設三個復孔,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min,每孔吸取上清100μl置平底96孔培養(yǎng)板中,同時加入乳酸脫氫酶基質(zhì)液100μl,反應3min,每孔加入1mol/L的HCl 30μl,在酶標儀490nm處測定光密度值(OD)。

    按下式計算NK細胞活性,受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性,即可判定該項實驗結(jié)果陽性。

    3.2 抗腫瘤功能研究

    3.2.1 實驗動物、劑量分組及受試樣品給予時間

    清潔級昆明種小鼠,雄性,18~22g,每組12只,共5組:模型對照組、樣品低、中、高劑量組(150、300、600 mg/kg·bw),陰性對照組給予蒸餾水,連續(xù)10d,受試物每天定時經(jīng)口灌胃各劑量組。

    3.3.2 抗腫瘤實驗

    將復蘇的S180細胞株(0.2mL/只)接種到昆明種小鼠腹腔內(nèi),第7d時選取生長良好的S180肉瘤細胞荷瘤鼠腹水,呈乳白色,按1:4加入無菌生理鹽水稀釋。同樣的方法(0.2mL/只),繼續(xù)傳兩代。選取生長良好的第二代荷瘤鼠腹水復制腫瘤動物模型。

    無菌抽取6只荷瘤鼠腹水,混合,按1:4加入無菌生理鹽水稀釋。0.4%臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù),細胞懸液:0.4%臺盼藍=1:9,混勻后染色5min,顯微鏡下計數(shù)活細胞數(shù),然后用無菌生理鹽水稀釋,調(diào)整活腫瘤細胞密度為1×107mL-1(冰浴中操作),按0.2mL/只接種于經(jīng)常規(guī)皮膚消毒后的待接種小鼠右前腋皮下,整個操作于30分鐘內(nèi)完成。

    各用藥組于造模后24小時開始灌胃給藥,模型對照組灌胃蒸餾水。連續(xù)10d。末次給藥后24h,頸椎脫臼處死小鼠,剝離腫瘤、并取脾臟和胸腺稱重,計算各組動物的平均瘤重、抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

    抑瘤率 =(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%

    脾臟指數(shù) = 脾臟重量 / 體重×100%

    胸腺指數(shù) = 胸腺重量 / 體重×100%

    4.實驗結(jié)果

    4.1 增強免疫功能

    4.1.1 樣品對小鼠體重、臟器比的影響

    圖1 攝入樣品后小鼠的初重和末重

    由圖1可知,與陰性對照組比較,經(jīng)口給予小鼠不同劑量樣品30 d,體重與陰性對照組比較均無顯著性差異(p>0.05)。

    圖2 攝入樣品后小鼠的臟器指數(shù)

    由圖2可知,經(jīng)口給予小鼠不同劑量樣品30 d,脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)在各劑量組與陰性對照組間比較均無顯著性差異(p>0.05)。

    4.1.2 樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響

    圖3 攝入樣品后小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應

    由圖3可知,與陰性對照組比較,攝入樣品的三個劑量組均有極顯著性差異(p<0.01)。

    4.1.3 樣品對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的影響

    由表1可知,與陰性對照組相比,樣品的三個劑量組小鼠脾淋巴細胞增值能力均增加(p<0.01)。

    表1 膠囊實驗小鼠MTT增值能力情況

    圖4 樣品對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

    圖4中結(jié)果顯示樣品對淋巴細胞的增殖能力與陰性對照比具有極顯著增加(p<0.01)。

    4.1.4 樣品對小鼠抗體積數(shù)的影響

    圖5 樣品攝入對小鼠抗體積數(shù)的影響

    由圖5可知,經(jīng)口給予小鼠不同劑量的樣品30 d,經(jīng)統(tǒng)計學分析,與陰性對照組比較,樣品的高劑量組有極顯著性差異(p<0.01)。

    4.1.5 樣品對小鼠單核-巨噬細胞碳粒廓清能力的影響

    圖6 樣品對小鼠單核-巨噬細胞碳粒廓清能力的影響

    由圖6可知,經(jīng)口給予小鼠不同劑量的樣品30 d,與陰性對照組比較,樣品的三個劑量組小鼠的巨噬細胞吞噬指數(shù)有一定的上升趨勢,中劑量組小鼠的碳粒廓清功能有顯著升高(p<0.05),高劑量組小鼠有極顯著升高(p<0.01)。

    4.1.7 樣品對NK細胞活力的影響

    表2 膠囊實驗小鼠NK細胞活力情況

    由表2可知,與陰性對照組相比,樣品中、高劑量組具有極顯著性差異(p<0.01)。

    4.2 抗腫瘤功能

    4.2.1.膠囊對荷瘤鼠體重及臟器指數(shù)的影響

    表3 膠囊藥物對荷瘤鼠體重及臟器指數(shù)的影響

    如表3所示,各組別之間初重、末重差異不存在顯著性(p>0.05),各劑量組荷瘤鼠的免疫器官相對質(zhì)量高于模型對照組,各劑量組脾臟指數(shù)的增長不具有顯著性(p>0.05)。

    4.2.2 膠囊藥物對小鼠S180肉瘤抑瘤率的影響

    表4 兩種膠囊藥物對小鼠S180肉瘤抑瘤率的影響

    如表4所示,樣品各劑量組平均瘤重均低于模型組,且差異呈顯著性(p<0.05)。說明樣品各劑量組均對小鼠S180肉瘤有抑制作用。

    5.結(jié)論

    樣品對小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)無明顯影響,但能增加小鼠足趾腫脹度、增加小鼠脾淋巴細胞增殖能力、增加小鼠的抗體積數(shù)、能增強小鼠的碳粒廓清功能以及增加小鼠NK細胞活力,因此均能提高小鼠的免疫功能。同時,樣品也體現(xiàn)出不同程度的抑制S180肉瘤的生長。

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