孕晚期婦女的社會經濟學因素、營養(yǎng)素攝入、腸道菌群和孕期增重的關系

馬良坤，薛 勇，何婷超，張玉梅

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產科，北京 100730 2中國科學院微生物研究所病原微生物和免疫學重點實驗室，北京 1001013北京大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，北京 100191

美國醫(yī)學研究所(Institute of Medicine，IOM)早在1990年就提出孕期增重的適宜范圍，目的是減少低出生體質量兒的發(fā)生率。2009年結合世界衛(wèi)生組織對成人體質量指數(shù)(body mass index，BMI)分類進一步完善，提出更為細致的推薦范圍[1]。孕期增重不適宜(不足和過量)與不良生殖結局密切相關，包括低于胎齡兒、大于胎齡兒、巨大兒、剖宮產、妊娠期糖尿病、子癇前期、產后體質量滯留和子代肥胖等[2]。既往報道指出孕期不合理增重與孕婦年齡、孕前體質量和孕期營養(yǎng)等因素有關[3- 5]。越來越多的證據顯示，腸道微生態(tài)失調在肥胖和其他代謝性疾病中扮演重要的角色[6- 7]，但目前有關腸道菌群和孕期增重關系的報道較少。本研究調查了孕婦社會經濟學因素和孕期增重情況，評估了孕晚期營養(yǎng)狀況，同時對孕晚期婦女的糞便樣本進行宏基因組檢測，探討了上述因素和孕期增重的關系，以期為孕婦營養(yǎng)干預和健康管理提供參考。

對象和方法

對象2015年10月至2016年5月在北京協(xié)和醫(yī)院婦產科參加產檢的健康孕婦98例。納入標準：(1)單胎；(2)年齡24～45歲；(3)孕齡≥27周；(4)在北京居住。排除標準：(1)過去1個月使用過抗生素；(2)妊娠期高血壓；(3)妊娠期糖尿病或孕前糖尿??；(4)心血管疾?。?5)慢性肝炎、慢性腎炎；(6)急、慢性胃腸炎；(7)肺結核、乙肝、人類免疫缺陷病毒感染等傳染性疾??；(8)精神疾病。本研究經北京大學倫理委員會批準(倫理號：IRB00001052- 15054)，所有研究對象均簽署知情同意書。

資料收集及分組孕婦在孕晚期產檢時進行問卷調查，收集信息包括年齡、民族、文化程度、孕齡、身高、孕前體質量等，并于分娩期測量產婦臨分娩前體質量。依據研究對象身高和孕前體質量計算孕前BMI，并根據孕前BMI分為低體質量組(<18.5 kg/m2)、正常體質量組(18.5～24.9 kg/m2)、超重組(25.0～29.9 kg/m2)和肥胖組4組(≥30.0 kg/m2)。孕期增重(kg)為臨分娩前體質量減去孕前體質量。根據孕期增重是否符合IOM推薦的孕期增重適宜范圍分為孕期增重不足組、孕期增重適宜組和孕期增重過量組3組。IOM孕期增重適宜范圍：孕前低體質量孕婦為12.5～18.0 kg、孕前正常體質量孕婦為11.5～16.0 kg、孕前超重孕婦為7.0～11.5 kg、孕前肥胖孕婦為5.0～9.0 kg。

營養(yǎng)狀況評估孕晚期時采用24 h膳食回顧的方法調查研究對象在過去24 h內所有攝入的食物，包括自制、市場購買等。經培訓合格的專業(yè)調查人員指導研究對象進行回憶，在膳食圖譜的幫助下回憶每種食物的攝入量。依據《食物成分表》(2002和2004版)計算能量、宏量營養(yǎng)素和微量營養(yǎng)素的攝入量。

便樣采集及處理采用專門的裝置采集，包括一次性便盆、無菌手套、含DNA穩(wěn)定劑的采樣管(STRATEC Biomedical AG，Birkenfeld，Germany)。DNA穩(wěn)定劑可保證便樣常溫放置3 d左右。采集當天或次日送到婦產科，并立即凍存到-80 ℃冰箱待檢。采用PSP Spin Stool DNA Plus試劑盒(STRATEC Biomedical AG，Birkenfeld，Germany)進行便樣DNA的提取，NanoDrop 1000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)測量DNA濃度，A260/A230吸光度比值在1.8～2.0間，并用1%瓊脂糖凝膠電泳評價DNA提取質量。采用NEXTflexTMRapid DNA-Seq試劑盒進行DNA文庫構建，Illumina HiSeq X Ten platform進行雙端測序。

質量控制和物種豐度計算下機所得原始數(shù)據進行過濾后得到有效數(shù)據(clean data)，過濾步驟如下：(1)去除所含低質量堿基(質量值≤38)超過一定比例的reads；(2)去除N堿基達到一定比例的reads；(3)去除與Adapter之間重疊超過一定閾值的reads；(4)過濾掉宿主的reads(采用SoapAligner軟件)。使用Metaphlan2軟件[8]對Clean Data進行分析，獲得不同分類層級的物種豐度表(物種豐度是指計算樣品中各微生物所占百分比)。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，事后檢驗采用LSD；分類資料的組間比較采用卡方檢驗；所有檢驗均為雙側，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。在種的水平上計算Alpha多樣性(指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性，常用物種豐富度來度量)，包括Shannon指數(shù)(假設在無限大的群落中對個體隨機取樣，而且樣本包含了群落中所有的物種，個體出現(xiàn)的機會即為多樣性指數(shù))和Simpson指數(shù)(假設對無限大的群落隨機取樣，樣本中兩個不同種個體相遇的概率可認為是一種多樣性的測度)，采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗比較組間Alpha多樣性差異，采用LEfSe分析比較不同組間差異明顯的菌群，并計算相應線性判別式分析(linear discriminant analysis，LDA)得分，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05和LDA>2.0為組間差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一般情況98名孕婦的平均年齡為(32.7±3.4)歲(24.6～42.6 歲)，平均孕齡為(32.8±3.3)周(27～40 周)；民族以漢族(91.8%)為主，文化程度以大學及以上(91.8%)為主。根據孕期增重是否符合IOM推薦范圍分為：(1)孕期增重不足組(n=15，15.3%)：平均增重(8.8±2.7)kg(3.5～11.0 kg)；(2)孕期增重適宜組(n=34，34.7%)：平均增重(13.4±1.8)kg(9.0～16.5 kg)；(3)孕期增重過量組(n=49，50.0%)：平均增重(19.0±3.0)kg(14.0～31.0 kg)。3組間在年齡(F=2.495，P=0.088)、孕齡(F=0.696，P=0.501)、民族(χ2=0.065，P=0.968)、文化程度(χ2=0.827，P=0.661)、身高(F=2.283，P=0.108)、孕前體質量(F=0.392，P=0.677)和孕前BMI(F=0.121，P=0.887)方面差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

孕晚期營養(yǎng)素攝入24 h膳食回顧調查顯示，相比孕期增重不足組，孕期增重過量組脂肪(F=3.113，P=0.049)、α-生育酚(F=4.419，P=0.015)攝入較高，而碳水化合物(F=3.750，P=0.027)、膳食纖維(F=4.499，P=0.014)、鈣(F=7.380，P=0.001)、鉀(F=5.209，P=0.007)和硒(F=3.303，P=0.041)攝入較低(表2)。

腸道菌群信息和多樣性比較采用Metaphlan2軟件對Clean Data進行分析，結果發(fā)現(xiàn)有351個種，屬于121個屬和12個門。在種的水平上計算Alpha多樣性，結果顯示，孕期增重不足組、孕期增重適宜組和孕期增重過量組的Shannon指數(shù)分別為3.05(2.63，3.31)、3.04(2.88，3.22)和3.03(2.58，3.20)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.891，P=0.641)；Simpson指數(shù)分別為0.91(0.87，0.94)、0.92(0.89，0.93)和0.91(0.85，0.93)，差異也無統(tǒng)計學意義(χ2=1.097，P=0.578)。

腸道菌群組間比較結果采用LEfSe分析比較不同組間差異明顯的腸道菌群，結果顯示：在門水平上，孕期增重過量組Verrucomicrobia豐度顯著高于孕期增重適宜組；在屬水平上，孕期增重過量組Akkermansia和Atopobium豐度顯著高于孕期增重適宜組，而Holdemania和Sutterellaceaeunclassified豐度顯著較低；在種水平，孕期增重過量組Akkermansiamuciniphila、Atopobiumparvulum和Alistipesindistinctus豐度顯著高于孕期增重適宜組，而Lactobacillusrhamnosus、Weissellaunclassified、Eubacteriumventriosum、Ruminococcustorques和Bacteroidesuniformis豐度顯著較低。進一步比較孕期增重不足組和孕期增重適宜組的菌群差異，結果顯示：在門水平上，兩組未見顯著性差異；在屬水平上，孕期增重不足組Dialister、Anaerococcus和Parvimonas豐度顯著高于孕期增重適宜組；在種水平上，孕期增重不足組Dialisterinvisus、Alistipesunclassified、Peptoniphilusharei、Escherichiaunclassified、Parvimonasunclassified、Campylobacterureolyticus、Lactobacilluscrispatus和Fusobacteriumnucleatum豐度顯著高于孕期增重適宜組，而Eubacteriumventriosum豐度顯著較低(圖1、2)。

討 論

孕期合理的體質量增加不僅有助于胎兒正常的發(fā)育，也有助于減少妊娠期并發(fā)癥和促進產后的健康。部分孕期婦女由于體力活動減少，同時攝入大量高蛋白、高熱量的食物，容易導致體質量過量增加。本研究顯示孕期體質量增加符合推薦范圍者僅占34.7%，高達50.0%孕婦體質量增加高于推薦值范圍。杜秋菊等[9]對合肥市929例足月單胎孕產婦的調查顯示，孕期體質量增長過量者達47.3%。邵盈盈等[3]對2000至2014年浙江舟山市孕婦孕期增重的變化趨勢進行分析，發(fā)現(xiàn)高達44.4%的孕婦增重超過推薦標準，并且有逐年增加的趨勢。綜上可見，隨著我國經濟發(fā)展和生活水平的提高，各城市地區(qū)孕期增重過高的現(xiàn)象比較常見。

代正燕等[4]研究發(fā)現(xiàn)，孕期增重和年齡、城市相關，城市地區(qū)孕期增重過多率較高，年齡偏大的更容易孕期增重過多。邵盈盈等[3]也調查顯示，孕期增重和孕婦年齡、孕前BMI、文化程度、受孕季節(jié)等有關。本研究結果則顯示，孕期增重和年齡、民族、文化程度、孕前BMI等因素無關，推測其原因可能是樣本量有限，同時納入的研究對象基本信息比較類似。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)孕期增重過量組脂肪攝入顯著高于孕期增重不足組，而碳水化合物和膳食纖維攝入則相反，可見脂肪攝入相比碳水化合物和膳食纖維更容易導致孕期體質量增加。

表 1 組間一般情況的比較Table 1 Comparisons of general data among three groups

GWG：孕期增重；BMI：體質量指數(shù)

GWG：pregnancy weight gain；BMI：body mass index

表 2 3組膳食營養(yǎng)素攝入的比較Table 2 Comparisons of dietary nutrient intake among three groups

人體共生的腸道菌群在維持機體正常的代謝、消化和免疫功能等方面發(fā)揮著重要作用，既往研究證明，腸道菌群紊亂與肥胖、糖尿病和心血管疾病等密切相關[10]。孕期攝入大量的高能量、高蛋白的食物，很容易導致體質量增加過量，腸道菌群在其中可能扮演重要角色。有研究檢測不同孕期的便樣，發(fā)現(xiàn)隨著孕周的增加，菌群多樣性顯著降低，而Proteobacteria和Actinobacteria出現(xiàn)明顯增加[11]。進一步對功能進行挖掘，發(fā)現(xiàn)孕晚期腸道菌群介導炎癥和能量損耗的能力明顯增加，可見腸道菌群可能深入參與孕婦的炎癥反應和能量代謝等。本研究深入分析了腸道菌群和孕期體質量增加的關系，雖然Alpha多樣性各組未見顯著性差異，但在不同進化等級上均發(fā)現(xiàn)腸道菌群和孕期增重存在明顯關聯(lián)。Stanislawski等[12]采用16S RNA基因測序的方法分析了169例孕婦分娩前的便樣，也發(fā)現(xiàn)孕期增重和腸道菌群存在密切關聯(lián)。本研究結果顯示，與孕期增重適宜組相比，孕期增重過量組Akkermansiamuciniphila、Atopobiumparvulum和Alistipesindistinctus豐度明顯較高，而Lactobacillusrhamnosus、Weissellaunclassified、Eubacteriumventriosum、

圖1LEfSe分析比較孕期增重過量組和適宜組腸道菌群組成的差異

Fig1Differences of gut microbiota between excessive and appropriate gestational weight gain groups using LEfSe analysis

圖2LEfSe分析比較孕期增重不足組和適宜組腸道菌群組成的差異

Fig2Differences of gut microbiota between insufficient and appropriate gestational weight gain groups using LEfSe analysis

Ruminococcustorques和Bacteroidesuniformis豐度明顯較低。Lactobacillusrhamnosus是常見的益生菌，廣泛應用于食品和保健品中，具有調節(jié)腸道菌群平衡、改善乳糖代謝、降低膽固醇等功能[13]，孕期增重適宜組Lactobacillusrhamnosus豐度的較高可能有助于孕婦維持其腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，并改善其糖、脂代謝，繼而促進孕期體質量的合理增加。Eubacteriumventriosum、Ruminococcustorques和Bacteroidesuniformis均能通過酵解纖維素產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)，SCFAs尤其是丁酸對于調節(jié)腸道菌群，維持腸道上皮細胞功能等具有重要意義，同時SCFAs的產生也能降低食欲，緩解周圍組織的胰島素抵抗[14]，可見SCFAs產生菌的富集可能是孕期增重適宜組體質量合理增加的重要原因。與此同時，我們也發(fā)現(xiàn)孕期增重不足組中多種微生物的豐度顯著高于孕期增重適宜組。其中Fusobacteriumnucleatum是口腔中的一種常見菌，與牙周病有關，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)usobacteriumnucleatum能夠轉移到胎盤，進而導致早產[15]。流行病學調查資料顯示，孕期增重不足是早產的危險因素[16]，腸道菌群是否在其中發(fā)揮一定的作用有待于進一步研究。

綜上，本研究結果顯示，孕期不合理增重現(xiàn)象比較普遍，除脂肪、碳水化合物、膳食纖維攝入外，腸道菌群和孕期增重也存在顯著關聯(lián)。腸道菌群與孕期營養(yǎng)代謝、分娩結局、后代健康的關聯(lián)有待于進一步研究。