固定化技術(shù)提高微生物對土壤中石油烴降解性能研究進(jìn)展

王曉玲，陳宏坤，鄭 瑾，韓占濤，高春陽

(1.中國地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)研究所，河北石家莊 050061;2.石油石化污染物控制與處理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國石油集團(tuán)安全環(huán)保技術(shù)研究院，北京 102206；3.河北省、中國地質(zhì)調(diào)查局地下水污染機(jī)理與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050061)

在過去的幾十年里，石油一直是人類最主要的燃料來源之一,也是石油化工的基礎(chǔ)[1-2]。石油在開采、冶煉、運(yùn)輸和使用過程中往往發(fā)生泄漏，造成大量水土環(huán)境的污染[3]。石油烴包括飽和烴、芳香烴、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)4種主要組分，其中多環(huán)芳烴等有致癌、致畸、致突變特性[2,4]，因此，石油污染一直是國際環(huán)境修復(fù)界的重要修復(fù)目標(biāo)。當(dāng)前我國的石油污染已經(jīng)顯現(xiàn)，水土環(huán)境石油污染的修復(fù)工作正在興起。高效、低成本、不產(chǎn)生次生污染的修復(fù)技術(shù)仍是石油污染修復(fù)領(lǐng)域的重要研發(fā)方向[5]。石油污染土壤的修復(fù)方法包括焚燒、熱脫附、化學(xué)淋洗、化學(xué)氧化、電動修復(fù)、生物添加、生物催化、生物堆等[6]。其中生物修復(fù)方法由于其經(jīng)濟(jì)可行性和環(huán)境友好性成為最受歡迎的修復(fù)方式[7]。但在自然環(huán)境中，由于土著微生物的競爭，土壤酸堿度、溫度以及石油烴的毒性效應(yīng)使得外源高效降解菌難以發(fā)揮其作用[8]。

固定化菌是將降解菌以某種方式固定在一種材料上，所形成的固定化菌比游離菌適應(yīng)環(huán)境能力更強(qiáng)[9]，可以抵抗環(huán)境毒性，實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞協(xié)同作用。多種石油烴高效降解菌，如寡養(yǎng)食單胞菌、芽孢桿菌、假單胞菌屬、無色菌屬、芽孢桿菌屬、小單胞菌屬等[10-12]都可以做成修復(fù)土壤石油污染的固定化菌。近年來，固定化微生物的研究正在興起，將會給微生物修復(fù)技術(shù)帶來革新性變化[7]。但是以往研究中對固定化降解菌的作用機(jī)理分析不夠。為此，該研究在對以往固定化微生物技術(shù)修復(fù)石油烴和其他有機(jī)污染效果和作用機(jī)理進(jìn)行探討的基礎(chǔ)上，針對不同條件下的石油烴污染土壤，提出相應(yīng)的微生物固定化方法，以期推動固定化微生物技術(shù)的應(yīng)用。

1 固定化微生物技術(shù)及材料

1.1固定化微生物技術(shù)固定化微生物技術(shù)興起于20世紀(jì)60年代，主要由固定化酶技術(shù)發(fā)展起來[13]，固定化微生物的方式包括吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、細(xì)胞交聯(lián)等[14]。固定化方式與載體材料和結(jié)構(gòu)是決定固定化微生物性能的主要因素，現(xiàn)階段主要的固定化方式主要有吸附法、包埋法和交聯(lián)法等。各種固定化方法的性能如表1所示。吸附法和包埋法是目前最常用的2種方法[15]，其中吸附法的吸附作用包括物理吸附和離子吸附。物理吸附使用的是硅藻土[16]、活性炭[17]等具有高表面吸附能力的物質(zhì)[18]。離子吸附是利用微生物帶電的表面特性，通過離子鍵將微生物固定于帶有相反電荷的固定材料上[15]。包埋法是將細(xì)胞分散到多孔載體內(nèi)部，或利用高聚物形成凝膠時(shí)將細(xì)胞包埋在內(nèi)部，從而達(dá)到固定細(xì)胞的目的[19]。交聯(lián)法是利用2個功能團(tuán)以上的試劑直接與微生物細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)，形成共價(jià)鍵來固定微生物[18]。

1.2固定化載體材料固定化載體材料的主要作用是為微生物提供適宜生存的微環(huán)境，不同的原料及不同的制備方法與工藝生成的材料性能各不相同[20]。載體的比表面積、孔隙大小、結(jié)構(gòu)是選擇固定化材料的主要依據(jù)，這些因素顯著影響微生物負(fù)載量[21]。

表1 不同固定化方法的性能

固定化材料總體上可分為人工合成材料和天然材料。人工合成材料主要為各種高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚氨酯等[22]。由于部分合成高分子材料的生物毒性及環(huán)境不兼容等問題，這類材料在應(yīng)用于原位土壤修復(fù)時(shí)往往受到質(zhì)疑而難以廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用比較多的是各種天然材料或改性天然材料[23]，如炭質(zhì)材料[24]、木屑[25]和改性植物秸稈[24]等，這些材料可以用于污染土壤的原位修復(fù)而不用考慮回收問題。生物炭作為載體材料，可以發(fā)揮其降低土壤的密度、提高土壤的持水力、改良土壤性質(zhì)、增強(qiáng)土壤肥力等優(yōu)勢[27-28]。在脫水干燥和儲存過程中，天然材料更有利于保持細(xì)胞活性[14]。載體材料的孔隙度、比表面積和表面化學(xué)特性都會影響微生物負(fù)載量，通過改性可以改變載體表面的官能團(tuán)等[29]，改性后的載體負(fù)載降解菌，污染物的去除效率也得到提高。載體材料的改性方式包括酸改性或者堿改性[30-31]、鹽改性(如氯化鐵改性，硫酸亞鐵和碳酸鈣改性)[32]等。表面活性劑有時(shí)也作為制備固定化微生物的助劑，但表面活性劑一定程度上降低了固定化微生物對污染物的降解效率[33]，且一般化學(xué)表面活性劑具有殺菌作用，因而表面活性劑改性對微生物的作用還存在爭議。從生物質(zhì)中直接提取的黃腐酸可以起到表面活性劑的作用[34]，且黃腐酸直接來源于生物質(zhì)，不會影響微生物活性，黃腐酸[35]以及其它生化腐殖酸[36]已經(jīng)被證實(shí)對土壤中多環(huán)芳烴和石油烴的去除有相當(dāng)?shù)呢暙I(xiàn)作用,因而這些腐殖酸可能會代替化學(xué)合成表面活性劑作為制備固定化微生物的助劑。

1.3固定化工藝吸附法制作固定化微生物工藝：將載體經(jīng)過滅菌處理后，與一定濃度待固定降解菌液按設(shè)計(jì)比例混合，共同培養(yǎng)一段時(shí)間，微生物通過氫鍵、范德華力、電荷間作用力、疏水相互作用力等吸附在載體的表面[37-39], 然后將菌液離心，將吸附微生物的載體與菌液分離，再將分離出的固定化微生物根據(jù)其保存條件要求保存在一定溫度和濕度的容器中待用。交聯(lián)法與包埋法具有一定的相似性，主要區(qū)別在于交聯(lián)法需要用2個功能基團(tuán)以上的試劑作為交聯(lián)劑將微生物與載體通過形成共價(jià)鍵進(jìn)行聯(lián)結(jié)，戊二醛是常用的交聯(lián)劑。交聯(lián)法的工藝是將交聯(lián)劑、包埋劑按一定比例與微生物混合均勻，靜置一段時(shí)間使交聯(lián)反應(yīng)完成，然后將混合液通過蠕動泵或注射器滴加到高價(jià)離子溶液如氯化鈣中使混合了微生物的包埋劑凝聚成小球[40-41]，保存于一定的溫度和濕度條件備用。包埋法與交聯(lián)法的區(qū)別在于包埋過程中不加入交聯(lián)劑，直接將包埋劑與微生物混合均勻后，再滴入高價(jià)離子鹽團(tuán)聚成微球[42]。

2 固定化微生物對土壤中石油污染物的降解效果

目前，固定化微生物技術(shù)在土壤修復(fù)中的現(xiàn)場應(yīng)用還比較少，但已經(jīng)有相當(dāng)數(shù)量的實(shí)驗(yàn)室研究，表2是現(xiàn)有研究中固定化微生物對土壤中石油污染物的去除率統(tǒng)計(jì)。

從表2可以看出，絕大部分載體材料選用炭質(zhì)或硅質(zhì)多孔材料作為吸附劑吸附降解菌，部分選用殼聚糖、結(jié)冷膠2種材料包埋降解菌。大部分固定化降解菌對污染物的降解速率顯著高于游離菌。例如，以聚氨酯泡沫為載體吸附芽孢桿菌屬，用于填充床生物反應(yīng)器降解土壤中的苯，苯去除率達(dá)到90%，而游離菌屬的降解率僅為70%[48]；且部分固定化材料可以與降解菌協(xié)同作用增加石油污染物的去除率，如黏膠基氈狀活性炭纖維固定石油降解菌試驗(yàn)中，油污的降解效率顯著高于游離菌[44]。固定化降解菌還可以降解游離菌不能去除的物質(zhì)，如生物炭固定化微生物修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤時(shí)，固定化降解菌可以降解游離菌不能降解的熒蒽和芘[33]。固定化的微生物可以重復(fù)利用，極大程度地降低成本。采用生物大分子仿生合成納米多孔SiO2作為載體，負(fù)載石油降解菌，用于土壤試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)固定化微生物在50 h內(nèi)降解率達(dá)到96.2%，降解率高于游離菌30%，重復(fù)利用8次后降解率仍在85%以上[45]。混合材料作為固定化載體，在提高石油污染物降解率的同時(shí)，還增加固定化小球的強(qiáng)度，也為提高重復(fù)利用率而做出貢獻(xiàn):將海藻酸鈉和硅藻土混合作為載體，石油降解率可以提高8.6%[17]；以海藻酸鈉和活性炭進(jìn)行交聯(lián)作為載體，固定降解菌，降解土壤中的菲和芘，240 h之后固定化細(xì)菌對菲和芘的降解率分別高于游離菌37.04%和20.85%[46]；利用活性炭和海藻酸鈉混合材料作為載體，當(dāng)活性炭含量為0.8%時(shí)，破損率最低，滲透性最好，同時(shí)提高了石油降解菌的耐鹽性[47]。固定化微生物技術(shù)還可以顯著縮短微生物遲滯期，結(jié)冷膠固定微生物降解汽油時(shí)，與游離微生物相比，在5 d內(nèi)相同濃度的微生物在固定化條件下對汽油的降解率達(dá)到90%，而游離微生物在30 d后才達(dá)到其最高水平，且汽油的去除率低于固定化降解菌[48]。

3 固定化微生物技術(shù)提高污染物降解率的機(jī)理

以黑色不規(guī)則圖形代表土壤顆粒，灰色不規(guī)則圖形代表固定化微生物載體，加入載體后，可以使土壤孔隙度增加,多孔載體可以提高氧氣的傳遞速率(圖1a)；對放大的微生物載體，帶環(huán)長鏈代表石油烴大分子，不同形態(tài)的細(xì)菌代表不同石油烴降解菌；N、P、K營養(yǎng)物質(zhì)以分子式表示，載體對降解菌的作用可以歸結(jié)為：①載體內(nèi)部具有孔隙結(jié)構(gòu)，降解菌群存在于載體內(nèi)部的孔隙中，可以避免外界不良因素的影響；②不同的降解菌可以發(fā)揮協(xié)同和共代謝的作用；③載體材料本身含有的或者額外施加的營養(yǎng)元素，可以直接供給降解菌吸收，促進(jìn)降解菌的生長；④石油烴分子吸附于載體表面或者孔隙中，增加降解菌與它的接觸機(jī)率，從而提高降解效率(圖1b)。

3.1利用載體屏蔽外界不良環(huán)境因素由于土壤環(huán)境的復(fù)雜性及污染物的高毒性，使得游離微生物的降解效率低。固定化載體可以為微生物提供相對舒適的微環(huán)境[49]，從而提高微生物的降解效率；固定化載體有大量的孔隙，比表面積大，可負(fù)載大量微生物[50]，幫助微生物抵制外界的毒性干擾，降低外界環(huán)境的抑制作用，可以大量縮短降解菌的適應(yīng)期[25,49]，為菌群大量繁殖提供基礎(chǔ)。

表2 固定化微生物對土壤中石油污染物的去除率

圖1 固定化微生物降解石油烴機(jī)理Fig.1 Degradation machanism of petroleum hydrocarbons by immobilized microbes

3.2固定化載體的吸附作用污染物的低生物可利用性[51]是限制微生物降解速率的步驟之一；利用載體對石油污染物的吸附作用[52]，可以增大污染物與微生物的接觸機(jī)會，提高目標(biāo)污染物的降解率。如黏膠基氈狀活性炭纖維固定石油降解菌試驗(yàn)中，活性炭纖維的物理吸附與微生物降解作用相結(jié)合，使油污的降解效率顯著高于游離菌[43]；如選擇BET比表面積大的生物炭固定耐鹽棒狀桿菌降解石油烴時(shí)，固定化微生物對目標(biāo)污染物的降解率最高，可以達(dá)到79.4%[53～54]。

3.3提高微生物活性及酶活性惡劣環(huán)境造成的低生物活性和酶促反應(yīng)速率低是生物修復(fù)的限速步驟，固定化載體可以提高微生物活性及酶活性，抵消由于溫度低對微生物活性限制的影響[52,55,57-58]，石油污染物在降解過程中，一系列的加氧酶、羥化酶起著最重要的作用，而不同的脫氫酶、多酚氧化酶等對底物加氧后的代謝起著更重要的作用[59]。固定化微生物的酶活性及代謝活性比游離微生物高，如海藻酸鈉和硅藻土3∶1混合作為負(fù)載材料，負(fù)載微生物比游離菌的生物活性高[17]；在竹炭負(fù)載微生物降解苯酚污染土壤試驗(yàn)中，添加固定化菌的土壤中多酚氧化酶、脲酶的活性以及微生物的多樣性可以恢復(fù)到未污染土壤中的酶活性水平[60]；這與Patil等[50]研究結(jié)果一致，固定化菌在毒性環(huán)境中，相對游離菌更容易繁殖；高溫裂解松木形成的生物炭作為載體負(fù)載下水道腸桿菌屬，通過定量PCR獲得土壤中綠色熒光蛋白的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)固定化微生物存活率顯著高于游離菌，這是由于生物炭中合適的N含量、pH、比表面積、持水力等都適合微生物繁殖后代，在苯作為唯一碳源的情況下，固定菌對苯的利用率遠(yuǎn)高于游離菌[61]。

3.4為微生物提供營養(yǎng)元素部分固定化載體可以為降解菌提供一定的營養(yǎng)元素，以殼聚糖作為載體固定化降解菌時(shí)，因殼聚糖本身含有碳源，起到固定化作用的同時(shí)，還可以起到生物刺激的作用，促進(jìn)土著降解菌的生長[62]。

3.5提高土壤中氧氣和水分子的傳遞速率載體具有多孔性結(jié)構(gòu)，對水分子也有強(qiáng)烈吸附性，施入土壤中，有效增加土壤孔隙度，同時(shí)提高土壤中氧氣的含量，氧氣濃度是未施加載體土壤中氧氣濃度的數(shù)倍，且倍數(shù)隨土壤深度增加[63]。

3.6其他機(jī)理改性后的載體材料會提高微生物對污染物的降解效率。利用氫氧化鈉和過氧化氫對花生殼進(jìn)行改性，破壞花生殼纖維素中的苯環(huán)，增加花生殼的孔隙度，最終增加其負(fù)載降解細(xì)菌的數(shù)量，改性后的花生殼固定化菌對芘的降解率提高，且改性花生殼作為載體提高了微生物的活性[30]。但若過度改性，則對目標(biāo)物的降解率沒有貢獻(xiàn)，推測原因可能是過度改變載體表面結(jié)構(gòu)，使載體的吸附能力與降解菌的協(xié)同作用受到限制[26]。固定化微生物可以在載體吸附底物形成污染物膜的前提下生存[24]，同樣是高污染物濃度，游離微生物卻不能生存；也有研究認(rèn)為固定化載體對污染底物的吸附，會限制降解菌的降解率[57]。

4 不同環(huán)境下固定化微生物技術(shù)的優(yōu)化途徑

固定化技術(shù)通過多種機(jī)理提高降解微生物對土壤中石油污染物的降解性能，針對不同的土壤環(huán)境，可以選擇與其相適應(yīng)的固定化技術(shù)，并對固定化方法進(jìn)行優(yōu)化。首先，載體材料的組成和結(jié)構(gòu)對其降解效果起著至關(guān)重要的作用，要進(jìn)一步開發(fā)能夠適應(yīng)多種土壤環(huán)境、固定化微生物降解性能高的材料。其次，對復(fù)合降解菌組成的優(yōu)化，添加適當(dāng)濃度的營養(yǎng)元素，以及對固定化載體的表面進(jìn)行改性也是重要的優(yōu)化方向。以海面漏油污染的濱海潮間帶為例，影響海面漏油生物修復(fù)的主要原因有營養(yǎng)鹽、微生物及潮汐作用。潮汐作用會導(dǎo)致營養(yǎng)鹽、菌劑的流失，不能有效促進(jìn)潮間帶砂層中石油污染物的降解，且造成局部海水富營養(yǎng)化等二次污染。以潮間帶環(huán)境特有的自然材料(如蝦加工廢料中殼聚糖鱗片及貝殼)固定耐鹽度高的微生物，添加交聯(lián)劑以減少微生物的擴(kuò)散流失，施加緩釋營養(yǎng)鹽，避免營養(yǎng)鹽擴(kuò)散流失及局部富營養(yǎng)化的出現(xiàn)[63-66]就是十分有效的優(yōu)化方法。

5 結(jié)論與展望

固定化微生物技術(shù)在石油烴污染土壤修復(fù)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，運(yùn)用較好的固定化技術(shù)負(fù)載的降解菌不僅降解效率顯著高于游離菌，還可以降解游離菌不能降解的污染物。

固定化載體提高降解效率的機(jī)理包括：①利用載體屏蔽不良環(huán)境條件；②固定化載體的吸附作用；③提高微生物活性及酶活性；④為微生物提供營養(yǎng)元素；⑤提高土壤中氧氣和水分子的傳遞速率等。

固定化微生物技術(shù)的很多影響因素(載體類型，固定化時(shí)間，粒徑大小，微生物種類，細(xì)胞密度及負(fù)載量)已經(jīng)得到研究，但關(guān)于改善傳質(zhì)速率、解釋相關(guān)基質(zhì)擴(kuò)散問題還有待進(jìn)一步研究。截至現(xiàn)在，固定化微生物技術(shù)對石油污染土壤的修復(fù)仍局限于實(shí)驗(yàn)室階段，只有很少一部分應(yīng)用于生物反應(yīng)器，未來更需要著眼于固定化微生物技術(shù)在石油污染場地的現(xiàn)場應(yīng)用等方面的研究。