普通PCR檢測方法在西藏地區(qū)鼠疫疫情判定中的應(yīng)用

格桑曲珍 索朗德吉 占堆

【摘 要】

目的：了解聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測方法在鼠疫疫情判定中的應(yīng)用。方法：通過檢測鼠疫耶爾森菌一個(gè)特異的目的基因（F1抗原基因、pla基因）檢測鼠疫耶爾森菌。結(jié)果：2只病死旱獺臟器組織經(jīng)PCR檢測，均呈現(xiàn)兩條與預(yù)期分子量相吻合的清晰目的擴(kuò)增帶。與膠體金、反相血凝試驗(yàn)（堆龍材料1：320、城關(guān)區(qū)材料1：5120）陽性完全相符。結(jié)論：PCR檢測方法具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)，在基層，偏遠(yuǎn)地區(qū)大力推廣，對(duì)及時(shí)、準(zhǔn)確判定鼠疫疫情及處置疫情，防止疫情蔓延具有重要的意義。

【關(guān)鍵詞】 普通PCR；鼠疫；疫情判定

Abstract Objective： understand the application of polymerase chain reaction （PCR） in the determination of plague outbreak.

Methods： a specific target gene （F1 antigen gene， PLA gene） was tested for yersinia pestis Results： PCR revealed two clear objective amplification bands that were consistent with the expected molecular weight. The results were consistent with the positive results of colloidal gold and reverse hemagglutination test （duilong material 1：320 and chengguan area material 1：5120）.

Conclusion： PCR detection method has the characteristics of quick， specific and sensitive. It is widely used in grassroots and remote areas， which is of great significance for timely and accurate judgment of plague outbreak and treatment of epidemic situation and prevention of epidemic spread.

【中圖分類號(hào)】R969.4 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

B 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）14-011-01

鼠疫作為一種古老的疾病被世界衛(wèi)生組織定為重新復(fù)燃的20種傳染病之一，目前其流行進(jìn)入一個(gè)新的活躍期[1]。西藏自治區(qū)自1966年-2017年50多年期間共判定了52個(gè)縣為鼠疫自然疫源地，面積84.85萬平方公里，占全區(qū)總面積的70.7%，且近年來疫情呈上升趨勢，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。然而我區(qū)目前主要應(yīng)用傳統(tǒng)的“四步檢驗(yàn)”方法，存在繁瑣、費(fèi)時(shí)和受材料腐敗等諸多因素的影響，給疫情的及時(shí)、準(zhǔn)確判定帶來了一定困難。通過對(duì)疫區(qū)鼠疫患者和疑似患者、流行區(qū)和非流行區(qū)鼠類、實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物和蚤等材料進(jìn)行的現(xiàn)場檢測和實(shí)驗(yàn)室研究，證明PCR檢測方法有高度的特異性和敏感性[2]。因此，2017年開始西藏地區(qū)逐步在鼠疫檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用PCR方法，并成功判定了2起動(dòng)物間鼠疫疫情。

1 材料與方法

1.1 被檢材料 采集于拉薩市堆龍德慶區(qū)德慶鄉(xiāng)和城關(guān)區(qū)奪底鄉(xiāng)2只病死旱獺臟器組織（心、肝、脾、肺）。

1.2 模板制備 取0.1g臟器研磨后取50ul上清液加入50ul無菌去離子水，倒入1.5ml微量離心管中，煮沸15min，離心10min（12000r/min），取上清液1-5ul進(jìn)行PCR檢驗(yàn)。

1.3 引物 選擇引物pla和F1基因片段，由上海輝睿生物科技有限公司合成供給。（生產(chǎn)批號(hào)：HR170420）.

1.4 PCR反應(yīng)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析：試劑盒的鼠疫耶爾森菌為陽性對(duì)照，Rnase H2O為陰性對(duì)照，PCR-Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量，按試劑盒說明書配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增及凝集電泳分析。

2 結(jié)果

2只病死旱獺臟器組織核酸提取后經(jīng)PCR檢測，均呈現(xiàn)兩條與預(yù)期分子量相吻合的清晰目的擴(kuò)增帶（F1：249bp；pla：456bp）。（圖1、圖2）。

3 結(jié)論

準(zhǔn)確判定一起鼠疫疫情，最終依據(jù)鼠疫實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果。根據(jù)2008年9月新修訂的《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS279-2008鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2]，對(duì)未分離到鼠疫菌的疑似標(biāo)本，除要求免疫學(xué)檢測陽性外，還要求基因檢測陽性，方可做出判斷[3]。經(jīng)普通PCR檢測，2只病死旱獺基因擴(kuò)增結(jié)果（圖1、圖2）與膠體金、反相血凝試驗(yàn)（堆龍材料1：320、城關(guān)區(qū)材料1：5120）陽性完全相符，在6-8小時(shí)內(nèi)成功判定了2起動(dòng)物間鼠疫疫情，改變了以往只有分離到鼠疫菌才能確診的局面，為疫情處置爭取了第一時(shí)間。

以往西藏地區(qū)鼠疫疫情絕大多數(shù)發(fā)生在地廣人稀，交通不便的農(nóng)牧區(qū)，呈散發(fā)和小流行，即使發(fā)生疫情，能通過傳統(tǒng)的“四步檢驗(yàn)”方法，判定疫情并控制疫情的蔓延。如今西藏旅游業(yè)快速發(fā)展，資源開發(fā)利用，疫區(qū)人類活動(dòng)頻繁，交通工具發(fā)達(dá)，人員流動(dòng)大，為疫情的遠(yuǎn)距離傳播創(chuàng)造了有利條件。西藏疫區(qū)面積大，發(fā)現(xiàn)病死旱獺尸體時(shí)，材料已經(jīng)腐敗嚴(yán)重或只剩下殘?bào)w，再送到地市級(jí)疾控中心強(qiáng)毒室時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)膠體金、反相血凝試驗(yàn)結(jié)果陽性，卻檢不出鼠疫菌，“四步檢驗(yàn)”方法無法及時(shí)準(zhǔn)確判定疫情。

新的診斷標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)后，一起鼠疫疫情的判定不需要等1-2天的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，大大縮短了確診時(shí)間，而且非常特異、敏感，節(jié)約人力、物力及經(jīng)費(fèi)，是緊急情況下檢測鼠疫的有力手段。因此，PCR檢測方法在基層，偏遠(yuǎn)地區(qū)大力推廣，對(duì)及時(shí)、準(zhǔn)確判定鼠疫疫情及處置疫情，防止疫情蔓延具有重要的意義，從而保障人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全。

參考文獻(xiàn)

[1] 頓珠，其加次仁，多吉格桑，等.加強(qiáng)鼠疫監(jiān)測 嚴(yán)防人間鼠疫 確保邊疆穩(wěn)定[J].西藏醫(yī)藥雜志，2013，34（04）：44-45.

[2] 石麗媛，郭英，張福新，等.應(yīng)用PCR方法檢測鼠疫現(xiàn)場標(biāo)本的研究[J].疾病預(yù)防控制通報(bào)，2013，28（2）：1-3.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.WS279-2008 鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[4] 王鵬，張福新，郭英，等.云南省玉龍縣一起鼠間鼠疫的實(shí)驗(yàn)室判定[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25（8）：1105-1107.