EGFR和TREM—1在食管癌中的表達(dá)及黃芪多糖通過抑制炎癥因子輔助食管癌治療的作用研究

孫小虎 王璐 于洪 張文陸

【摘 要】

目的：探討表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1（TREM-1）在食管癌（EC）組織中的表達(dá)及其與臨床病例特征之間的關(guān)系。方法：選取食管癌組織及癌旁組織各72例，采用SP免疫組化染色法檢測(cè)EGFR及TREM-1的表達(dá)，分析兩者與EC之間的臨床病理相關(guān)性。另選取食管癌患者術(shù)后給予APS注射液，測(cè)定APS對(duì)血生化指標(biāo)的影響；采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-2，IL-6的含量。結(jié)果：食管癌組織中EGFR和TREM-1的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，兩者呈正相關(guān)（P<0.05）。EGFR的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，TREM-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。黃芪多糖治療可以改善EC手術(shù)患者生化指標(biāo)，降低IL-2和IL-6的水平，與P-CT組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：EGFR與TREM-1在EC組織中高表達(dá)，且EGFR與TREM-1兩者之間的表達(dá)呈正相關(guān)性?？勺鳛槭彻馨╊A(yù)后判斷和基因治療的分子靶標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 食管癌；表皮生長(zhǎng)因子受體；髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1

【中圖分類號(hào)】R446.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

A 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）14-003-01

Expression of EGFR and Trem-1 in Esophageal Carcinoma and the Inhibiting Role of APS in the Treatment of EC by Inflammatory Factors

SunXiaohu1，2，Wang Lu2， Yu HONG2，Zhang Wenlu1*

（1.Jinzhou Medical University，Liaoning，Jinzhou 121001；2.Liaoning Cancer Hospital，Liaoning，Shenyang 110042）

Abstract Objective： The aim of this study is to investigate the expression and clinical significance of EGFR （epidermal growth factor receptor） and TREM-1 （trigger receptor of myeloid cells -1） in esophageal carcinoma （EC）. Methods： The study tested 72 cases of EC tissues and 72 cases of para-carcinoma tissue. The expressions of EGFR and TREM-1 were detected by SP immuno-histochemical method.Then analyze the relationships and the correlations between these two antibodies and the clinical pathological factors of esophageal carcinoma. Moreover， APS were given to EC patients， then monitored the numerical value；Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was was used to test the numerical value of IL-2，IL-6.

Results： Compared with para-carcinoma tissue group， the expression of EGFR and Trem-1 were significantly increased in EC group，there was a positive correlation between the expression of the two （P<0.05）. The expression of EGFR was possitively correlated to depth of invasion，lymph node metastasis and clinical stages；the expression of TREM-1 was possitively correlated to depth of lymph node metastasis. Compared with normal control P-CT group， the level of IL-2 and IL-6 in APS group were decreased， and the biochemical criterion were significantly IMPROVed in APS group （P<0.05）.

Conclusions： The expression of TREM-1 and EGFR were significantly increased in EC and P-CT groups， and the expression of EGFR and TREM-1 were possitively related. ， and may be employed to indicate the biomarker of prognosis of esophageal carcinoma patients and regarded as a target of gene therapy.

Key words：esophageal carcinoma； epidemal growth factor receptor；triggering receptor expressed on myeloid cells-1

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。我國(guó)EC的患病率近年呈逐年遞增趨勢(shì)，發(fā)病人群也逐漸呈年輕化趨勢(shì)[1，2]。手術(shù)治療仍是EC的首選治療手段，而晚期患者只能以延長(zhǎng)生存時(shí)間及改善生存質(zhì)量為主要治療目的[3-5]。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[6]。表皮生長(zhǎng)因子受體在多數(shù)人類腫瘤中也出現(xiàn)高表達(dá)。另外，白介素-2，白介素-6在腫瘤，特別是在EC中也表現(xiàn)出高表達(dá)的現(xiàn)象[7，8]。本研究檢測(cè)EGFR和TREM-1在EC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，探討EGFR與TREM-1的表達(dá)與食管癌的臨床病理特征的關(guān)系，為EC的診斷、治療及預(yù)后提供客觀的參考指標(biāo)；檢測(cè)EC組織中炎癥因子IL-2，IL-6的含量，同時(shí)為EC的傳統(tǒng)中藥綜合療法提供臨床理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織標(biāo)本 本研究隨機(jī)選取并整理了2016年3月至2017年6月于遼寧省腫瘤醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為EC的患者共72例作為受試對(duì)象。所有病例經(jīng)核實(shí)患者無重復(fù)，臨床病理資料完整。

1.1.2 試劑及耗材 兔抗人表皮生長(zhǎng)因子（即用型）（GT209307）購(gòu)自基因科技有限公司；兔抗TREM-1抗人單克隆抗體（ab214202）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；IL-2，IL-6酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D; SYSTEMS公司；EDTA抗原修復(fù)液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；注射用黃芪多糖（伯恩）購(gòu)自天津賽諾制藥有限公司。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機(jī)（LEICA-RM213）購(gòu)自德國(guó)萊卡公司；臺(tái)式水浴恒溫振蕩器（TSHZ-A）購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（SIEMENS Advia Centaur XP）購(gòu)自德國(guó)西門子公司；Olympus光學(xué)顯微鏡（H-600）購(gòu)自日本Olympus公司；德國(guó)生物信號(hào)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和標(biāo)本處理 本實(shí)驗(yàn)共分為二組：疾病模型組（EC組）：選取EC患者共72例，經(jīng)患者簽署知情同意書后，將受試患者的病理臘塊標(biāo)本及其相關(guān)的臨床病理資料作為疾病模型組。癌旁組織組（P-CT組）：選取上述72例食EC患者的癌旁組織（食管癌邊緣外≥2cm），作為癌旁組織組。

上述受試患者的食管標(biāo)本離體30min內(nèi)進(jìn)行處理。按照分組要求，切取面積約1.0cm×1.0cm的食管組織作為受試組織。取出的食管組織立即采用生理鹽水（Normal saline，NS）進(jìn)行漂洗，放入10%甲醛當(dāng)中進(jìn)行固定，標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋，進(jìn)行SP免疫組化，觀察病理改變。

1.2.2 SP免疫組化 高壓加熱沸騰 修復(fù)抗原，3%H：O：去離子水以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，分別滴加兔抗人表皮生長(zhǎng)因子（1：200）、兔抗TREM-1抗人單克隆抗體（1-200）（一抗），室溫孵育1h，滴加二抗，室溫孵育 30 min，PBS沖洗2 rain×3次，每張切片滴加DAB 顯色劑100 Ixl，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，PBS 洗滌，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.3 結(jié)果判定 在雙盲條件下進(jìn)行染色結(jié)果判定，每張組織切片在400倍光學(xué)鏡頭下隨機(jī)選取10個(gè)視野，依照細(xì)胞染色部位，染色密度及染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定。細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)染色評(píng)分：染色面積評(píng)估：隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)染色面積測(cè)定。0分：無陽(yáng)性細(xì)胞；1分：≤25%；2分：26-50%；3分：51%-100%。染色強(qiáng)度評(píng)分：指多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性：0分：無著色；1分：淡黃色；2 分：棕黃色；3 分：棕褐色。表達(dá)水平通過細(xì)胞染色比例及染色強(qiáng)度得分乘積判定。細(xì)胞膜評(píng)分：0分：無反應(yīng)或少于10%的細(xì)胞膜染色；1分：≥10%的細(xì)胞膜出現(xiàn)微弱染色；2分：≥10%的細(xì)胞側(cè)膜、基底側(cè)膜或完全膜出現(xiàn)中度染色；3分：≥10%細(xì)胞強(qiáng)染色出現(xiàn)在側(cè)膜、基底膜或全部染色； 上述分?jǐn)?shù)之和用來判斷Trem-1和EGFR結(jié)果，>2分者為陽(yáng)性，≤2分者為陰性。

1.2.4 術(shù)后黃芪多糖治療 在本部分中另外選取經(jīng)手術(shù)治療的食管癌患者20名及健康人10名作為受試對(duì)象，分為三組：空白對(duì)照組（N組）：10名健康人作為空白對(duì)照，不給予任何處理因素，只取血樣作為空白對(duì)照組。食管鱗癌術(shù)后模型組（EC組）：選取EC切除術(shù)后患者10名，術(shù)后給予常規(guī)處理，簽署知情同意書，入組。黃芪多糖治療組（APS組）：選取于我院行食管癌切除術(shù)治療的患者10名，術(shù)后予常規(guī)處理，給予APS注射液綜合治療，一次250mg，一日1次，用藥療程2周。

上述EC組及APS組受試對(duì)象，于術(shù)前及術(shù)后2周、N組于術(shù)前相同時(shí)間段分別采血，測(cè)定各組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白及特異性腫瘤生長(zhǎng)因子數(shù)值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

上述EC組及APS組受試對(duì)象經(jīng)APS治療2周后，采血，采用ELISA法測(cè)定炎癥因子IL-2及IL-6的含量。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋配制成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，加樣，配液，洗滌，顯色，終止反應(yīng)。測(cè)定：用酶標(biāo)儀于530nm處，測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）；通過已知標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及檢測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，計(jì)算各組檢測(cè)樣品的濃度。測(cè)定IL-2、IL-6的結(jié)果以nmol/mg 蛋白表示。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。兩組間的數(shù)據(jù)比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)計(jì)數(shù)資料行2 檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR在食管癌及癌旁組織中表達(dá) 免疫組化顯示，EGFR的陽(yáng)性表達(dá)表達(dá)在食管鱗癌組織中主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)；而在癌旁組織中弱表達(dá)于細(xì)胞膜上。陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.2及31.8%，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

2.2 TREM-1在食管癌及癌旁組織中的表達(dá)情況 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TREM-1的陽(yáng)性染色在EC組中主要定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中，在P-CT組中弱表達(dá)于細(xì)胞膜中，陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.4%及32.7%。兩組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=11.514，P<0.001）（見圖2A、2B）。

2.3 EC中EGFR和TREM-1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 對(duì)本實(shí)驗(yàn)中EGFR和TREM-1在食管鱗癌中的的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析，EGFR的表達(dá)與年齡、性別、組織分化程度無相關(guān)性（P>0.05），與腫瘤的浸潤(rùn)深度（P=0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、臨床分期（P=0.012）存在相關(guān)性（P<0.05）。TREM-1的表達(dá)與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小及TNM分期無相關(guān)性（P>0.05），在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中的陽(yáng)性率分別為77.1%和54.1%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見表1）。

2.3 EC中EGFR和TREM-1的表達(dá)的相關(guān)性 在72例EC患者的食管組織中，TREM-1和EGFR共同陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為46例，共同陰性表達(dá)例數(shù)為16例，經(jīng)X2 檢驗(yàn)列聯(lián)系數(shù)分析，兩者之間的表達(dá)成正相關(guān)（r=0.520，P<0.001）（見表2）。

2.4 術(shù)后APS對(duì)各組的治療作用比較

2.4.1 APS對(duì)血生化等指標(biāo)的影響 檢測(cè)與EC手術(shù)后治療情況密切相關(guān)的相關(guān)血生化等因子，包括TSGF、AST、TP和ALB。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出如下結(jié)果：ASP組及EC組（術(shù)前及術(shù)后2周）的血生化指標(biāo)與N組相比，TSGF、AST值升高，TP和ALB值下降，結(jié)果差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在ASP組中，經(jīng)過ASP治療2周后的各個(gè)血生化指標(biāo)與ASP治療前相比，TP和ALB值升高，TSGF和AST值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。另外，術(shù)前對(duì)比術(shù)后2周的ASP組及EC組同組別之間的生化指標(biāo)變化幅度，ASP組中TP和ALB值升高幅度及TSGF和AST值下降的幅度更明顯，存在顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見表3）。

2.4.2 ASP對(duì)術(shù)后炎癥因子IL-2、IL-6的影響檢測(cè)EC術(shù)后應(yīng)用ASP治療后炎性因子IL-2和IL-6的水平變化。ASP組患者的炎癥因子IL-2和IL-6水平與N空白組相近，無顯著性差異（P>0.05）。然而，將單純手術(shù)治療的EC組分別與N空白組和ASP治療組相比，炎性因子IL-2和IL-6均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見表4）。

3 討論

食管癌（EC）是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，近年來，EC除了患病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì)，患者也逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。手術(shù)治療仍然是EC所采用的的首選治療手段，目前，傳統(tǒng)中藥逐漸應(yīng)用到腫瘤的治療中，作為綜合治療手段，中藥越來越突顯出其治療的有效性。綜合治療對(duì)早、中、晚期的EC患者均有良好的治療作用[9，10]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TREM-1通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)影響了食管癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[11，12]；與其相似，EGFR也是一種跨膜的炎性蛋白。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，在EC的SP染色的組織切片中，TREM-1陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中，EGFR陽(yáng)性表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)；P-CT組中TREM-1和EGFR主要弱表達(dá)于細(xì)胞膜上，說明TREM-1和EGFR在EC中高表達(dá)，提示食管癌的發(fā)生、發(fā)展與TREM-1和EGFR密切相關(guān)。TREM-1和EGFR在EC中過度表達(dá)，且與腫瘤的TNM分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)深度存在相關(guān)性。這提示TREM-1和EGFR可能作為早期診斷EC的重要指標(biāo)，可以為EC的臨床診斷起到一定的輔助作用。

通過本次實(shí)驗(yàn)研究，我們還可以看出，EGFR與TREM-1在EC的表達(dá)中存在正相關(guān)性（r=0.520，P<0.05），提示兩者在EC的發(fā)生發(fā)展中存在某種協(xié)同作用。

在本試驗(yàn)中，通過對(duì)EC手術(shù)切除腫瘤的患者給予傳統(tǒng)中藥黃芪多糖進(jìn)行綜合治療，我們可以得知，與單純手術(shù)治療的EC患者相比，TSGF、AST值顯著下降且TP和ALB值升高。該結(jié)果提示，APS對(duì)EC手術(shù)患者有明顯的治療作用，降低患者術(shù)后的并發(fā)癥，改善患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。我們也可以發(fā)現(xiàn)，APS治療能明顯降低炎性因子IL-2及IL-6含量。因此，在EC的治療中，應(yīng)采取手術(shù)治療合并中藥治療的綜合療法。中藥與手術(shù)治療相結(jié)合有諸多好處，手術(shù)前應(yīng)用中藥扶正治療，可減少手術(shù)中的并發(fā)癥。手術(shù)后應(yīng)用的中藥抗腫瘤治療，可以控制癌癥的發(fā)展，以扶正和驅(qū)邪相結(jié)合，對(duì)治療EC有良好的治療效果[13]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了TREM-1和EGFR在CRC組織中的高表達(dá)，對(duì)結(jié)腸癌的的發(fā)生、發(fā)展起調(diào)節(jié)作用，為臨床防治CRC提供了重要的理論依據(jù)。同時(shí)，EC患者術(shù)后輔助以APS治療，能通過降低炎癥因子的表達(dá)，改善EC患者的血生化指標(biāo)，對(duì)開展食管癌輔助治療具有重要的實(shí)踐意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Kashyap MK， Abdel-Rahman O. Expression， regulation and targeting of receptor tyrosine kinases in esophageal squamous cell carcinoma. Mol Cancer. 2018；17（1）：54.

[2] Shi F， Shang L， Yang LY， et al. Neuropilin-1 contributes to esophageal squamous cancer progression via promoting P65-depenent cell proliferation. Oncogene. 2018；37（7）：935-943.

[3] Sakanaka K， Ishida Y， Fujii K，et al. Long-term outcome of definitive radiotherapy for cervical esophageal squamous cell carcinoma. Radiat Oncol. 2018；13（1）：7.

[4] Zhai S， Xue J， Wang Z，et al.. High expression of special AT-rich sequence binding protein-1 predicts esophageal squamous cell carcinoma relapse and poor prognosis. Oncol Lett. 2017；14（6）：7455-7460.

[5] Luo Y， Mao Q， Wang X，et al. Radiotherapy for esophageal carcinoma： dose， response and survival. Cancer Manag Res. 2017；10：13-21.

[6] Harada E， Serada S， Fujimoto M， et al. Glypican-1 targeted antibody-based therapy induces preclinical antitumor activity against esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2017；8（15）：24741-24752.

[7] Anvari K， Sima HR， Seilanian Toussi M， et al. EGFR Expression in Patients withEsophageal Squamous Cell Carcinoma and its Association with Pathologic Response to Preoperative Chemoradiotherapy： A Study in Northeastern Iran. Arch Iran Med. 2017；20（4）：240-245.

[8] Chen CL， Wang Y， Huang CY， et al. IL-17 induces antitumor immunity by promoting beneficial neutrophil recruitment and activation in esophageal squamous cell carcinoma. Oncoimmunology. 2017；7（1）：e1373234.

[7] Chen CL， Wang Y， Huang CY， et al. IL-17 induces antitumor immunity by promoting beneficial neutrophil recruitment and activation in esophageal squamous cell carcinoma. Oncoimmunology. 2017；7（1）：e1373234.

[9] Shang QX， Yang YS， Xu LY， et al. Prognostic significance and role in TNM stage of tumor deposits in esophageal cancer. J Thorac Dis. 2017；9（11）：4461-4476.

[10] Zheng WB， Li YJ， Wang Y， et al. Propafenone suppresses esophageal cancer proliferation through inducing mitochondrial dysfunction. Am J Cancer Res. 2017；7（11）：2245-2256.

[11] Wang X， Niu H， Fan Q， et al. Predictive value of EGFR overexpression and gene amplification on icotinib efficacy in patients with advanced esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016；7（17）：24744-51.

[12] Huang J， Fan Q， Lu P， et al. Icotinib in Patients with Pretreated Advanced Esophageal Squamous Cell Carcinoma with EGFR Overexpression or EGFR Gene Amplification： A Single-Arm， Multicenter Phase 2 Study. J Thorac Oncol. 2016；11（6）：910-7.

[13] Huang WH， Liao WR， Sun RX. Astragalus polysaccharide induces the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells by decreasing the expression of Notch1. Int J Mol Med. 2016；38（2）：551-7.