汞離子功能核酸生物傳感器的建立與應(yīng)用

杜再慧 李相陽(yáng) 田晶晶 田洪濤 許文濤

摘 要 利用汞離子（Hg2+）特異性功能核酸對(duì)Hg2+識(shí)別檢測(cè)，其中模板主要包括與Hg2+特異性結(jié)合的識(shí)別區(qū)、形成G四鏈體的富G區(qū)以及由聚六乙二醇（Spacer18）鏈接的隔斷區(qū)； 靶序列主要包括5'端配對(duì)區(qū)和3'端富T區(qū)。模板與靶序列只有在Hg2+存在的條件下才能結(jié)合并引發(fā)延伸，進(jìn)而使富G序列在模板上剝離下來，但由于Spacer18的隔斷作用導(dǎo)致富G序列以單鏈形式存在，在特定環(huán)境下形成具有過氧化物模擬酶活性的G-四鏈體，催化H2O2與2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）發(fā)生肉眼可見的顏色變化，進(jìn)而對(duì)Hg2+進(jìn)行定量測(cè)定。利用構(gòu)建的Hg2+功能核酸生物傳感器，35 min內(nèi)可完成檢測(cè)，線性范圍為20～500 nmol/L， 檢出限達(dá)到16.5 nmol/L （3σ）。 實(shí)際水樣中的加標(biāo)回收率為98.5%～103.5%。本方法操作簡(jiǎn)單、成本低、耗時(shí)短，在應(yīng)急處理、實(shí)時(shí)環(huán)境檢測(cè)等方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 汞離子； G四鏈體； 間隔臂； 功能核酸； 生物傳感器

1 引 言

汞 （Hg）是一種分布廣泛的重金屬，進(jìn)入環(huán)境后很難降解，可通過生物富集作用在動(dòng)物或人體內(nèi)積累，對(duì)人體健康具有極大的危害[1～3]。生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 5749-2006中規(guī)定Hg2+限量值為 1 mg/L[4]。建立一種廉價(jià)、快速、靈敏、特異性的Hg2+的檢測(cè)方法是非常必要的。傳統(tǒng)的Hg2+檢測(cè)方法主要包括原子吸收光譜法（AAS）[5]、原子熒光光譜法（AFS）[6]等，方法靈敏、檢出限低，但一般需要大型儀器和專業(yè)的操作人員，檢測(cè)周期長(zhǎng)，費(fèi)用高。近年來，研究者不斷開發(fā)出特異性金屬離子功能核酸， 具有易于修飾、成本低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7，8]，使得Hg2+功能核酸生物傳感器發(fā)展迅速[9]。

Hg2+能與富有胸腺嘧啶（T）的脫氧核苷酸鏈特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)[10]，其結(jié)合強(qiáng)度超過正常的腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）配對(duì)。因此T-Hg2+-T錯(cuò)配可以作為一種良好的Hg2+識(shí)別元件?；赥-Hg2+-T錯(cuò)配可引起寡核苷酸鏈結(jié)構(gòu)的變化、替換以及重組的原理建立的分析方法被廣泛用于Hg2+的檢測(cè)。近年來，在Hg2+與胸腺嘧啶相互作用的基礎(chǔ)上，研究者采用電化學(xué)[11～13]、熒光[14，15]或者比色[16～18]作為信號(hào)輸出方式， 建立了許多Hg2+檢測(cè)方法。 其中，比色傳感器具有無(wú)需分析儀器、肉眼可讀、快速、容易操作等優(yōu)點(diǎn)[19]，是Hg2+定點(diǎn)診斷、原位快速篩選的理想方法。最常見的比色傳感器是通過氯高鐵血紅素（Hemin）和富G序列形成的具有過氧化物模擬酶（HRP）活性的G四鏈體，可以在H2O2存在的條件下催化2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS2-）發(fā)生顏色變化。

本研究以帶有富G和隔斷的序列為模板對(duì)Hg2+進(jìn)行特異性檢測(cè)，靶序列與模板序列同時(shí)含有6個(gè)連續(xù)T堿基的序列，不存在Hg2+時(shí)，兩條序列不能結(jié)合，因此不發(fā)生延伸。當(dāng)溶液中含有Hg2+時(shí)，靶序列與模板間通過T-Hg-T堿基錯(cuò)配形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)， 在DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）和脫氧核糖核苷酸（dNTPs）存在的條件下發(fā)生延伸，但由于隔斷序列的存在，富G序列只能從模板上剝離下來，以游離的單鏈形式存在。在K+、Hemin存在的條件下，形成具有過氧化物模擬酶活性的G四鏈體； 在H2O2存在的條件下，催化ABTS發(fā)生肉眼可見的顏色變化，通過顏色的變化可以對(duì)Hg2+進(jìn)行定量檢測(cè)。

4 結(jié) 論

利用Hg2+和胸腺嘧啶特異性結(jié)合形成T-Hg-T堿基錯(cuò)配，進(jìn)而引發(fā)延伸反應(yīng)，發(fā)生鏈置換，釋放出單鏈富G序列，在K+和Hemin存在下形成具有過氧化物模擬酶活性的G-四鏈體，催化H2O2與ABTS發(fā)生肉眼可見的顏色變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的定量檢測(cè)，建立了一種Hg2+比色傳感器。此傳感器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果肉眼可見，具有良好的靈敏度和選擇性。檢出限達(dá)到16.5 nmol/L（3σ），可以滿足自來水樣品中Hg2+的檢測(cè)要求。

References

1 Boening D W. Chemosphere， 2000， 40（12）： 1335-1351

2 Nendza M， Herbst T， Kussatz C， Gies A. Chemosphere， 1997， 35（9）： 1875-1885

3 Leterme B， Blanc P ， Jacques， D. Environ.Sci.Pollut.Res.， 2014， 21（21）： 12279-12293

4 GB 5749-2006， Drinking Water Sanitary Standard. National Standards of the People's Republic of China

生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn). 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). GB 5749-2006

5 WANG Shuai， WANG Peng， WANG Xi-He， GAO Ji-Hui， ZHANG Zhi-Guo， WU Shao-Hua. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2009， 29（8）： 2262-2264

王 帥， 王 鵬， 汪細(xì)河， 高繼慧， 張治國(guó)， 吳少華. 光譜學(xué)與光譜分析， 2009， 29（8）： 2262-2264

6 WANG Mei， LI Shan， ZHOU Jian-Dong， XU Ying， LONG Jun-Biao， YANG Bing-Yi. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 34（8）： 2254-2258

王 梅， 李 姍， 周建棟， 徐 英， 龍軍標(biāo)， 楊冰儀. 光譜學(xué)與光譜分析， 2014， 34（8）： 2254-2258

7 Yang J， Dou B， Yuan R， Xiang Y. Anal. Chem.， 2016， 88（16）： 8218-8223

8 Zou M， Li D， Yuan R， Xiang Y. Biosens. Bioelectron.， 2017， 92： 624-629

9 Lee J S， Han M S， Mirkin C A. Angew. Chem. Int. Edit.， 2007， 119（22）： 4171-4174

10 Miyake Y， Togashi H， Tashiro M， Yamaguchi H， Oda S， Kudo M， Tanaka Y， Kondo Y， Sawa R， Fujimoto T. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（7）： 2172-2173

11 Hong M， Wang M， Wang J， Xu X， Lin Z. Biosens. Bioelectron.， 2017， 94： 19-23

12 Xuan F， Luo X ， Hsing I M. Anal. Chem.， 2013， 85（9）： 4586-4593

13 Cai W， Xie S， Zhang J， Tang D， Tang Y. Biosens. Bioelectron.， 2017， 98： 466-472

14 Chiang C K， Huang C C， Liu C W， Chang H T. Anal. Chem.， 2008， 80（10）： 3716-3721

15 Huang J， Gao X， Jia J， Kim J K， Li Z. Anal. Chem.， 2014， 86（6）： 3209-3215

16 Nolan E M， Lippard S J. Chem.Rev.， 2008， 108（9）： 3443-3480

17 Kim H N， Ren W X， Kim J S， Yoon J. Chem. Soc.Rev.， 2012， 41（8）： 3210-3244

18 Ren W， Zhang Y， ChenH G， Gao Z F， Li N B， Luo H Q. Anal. Chem.， 2016， 88（2）： 1385-1390

19 Liu J， Cao Z， Lu Y. Chem. Rev.， 2009， 109（5）： 1948-1998

20 Kotch F W， Fettinger J C， Davis J T. Org. Lett.， 2000， 2（21）： 3277-3280

21 Chai F， Wang C， WangT， Ma Z ，Su Z. Nanotechnology， 2009， 21（2）： 025501

22 Cai W， Xie S， Zhang J， Tang D， Tang Y. Biosens.Bioelectron.， 2017， 98： 466-472

23 Ngernpimai S， Matulakun P， Teerasong S， Puangmali T， Kopwitthaya A， Kanokmedhakul S， Sangiamdee D， Chompoosor A. Sens. Actuators B， 2018， 255： 836-842

24 Xu H， Geng F， Jiang X， Shao C， Wang Y， Wang K， Qu P， Xu M， Ye B C. Sens. Actuators B， 2018， 255： 1024-1030

25 Li Y， Liu N， Liu H， Wang Y， Hao Y， Ma X， Li X， Huo Y， Lu J， Tang S. Sci. Rep.， 2017， 7： 45974-45982

26 Wang G， Xu G， Zhu Y and Zhang X. Chem. Commun.， 2014， 50（6）： 747-750

Abstract Excessive mercury ions have negative effects on individual health. So， it is of great significance to develop a method for rapid， sensitive and specific detection of Hg2+. In this study， the method for detection of Hg2+ was developed based on specific T-Hg-T mismatche and G-quadruplex. The template sequence mainly included the recognition region which could combine with Hg2+ specifically， the rich G region which could form G-quadruplex， and the speacer 18 partition zone. The target sequence mainly included 5' ends combining area and 3' end T-rich region. Templates and targets could be combined and the elongation was triggered only in the presence of Hg2+. Furthermore， the G-rich sequences were stripped off the templates and could form a single-stranded structure， because Spacer 18 had partition function. The G-quadruplex was formed with the K+ and hemin， and catalyzed H2O2-2，2-azinobis （3-ethylbenzothiozoline）-6-sulfonic acid（ABTS） reaction with color variations. The detection could be done within 35 min， and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation with absorbance at 414 nm within range of 20-500 nmol/L， with a detection limit of 16.5 nmol/L （3σ）. The recoveries of Hg2+ spiked in tap water were 98.5%-103.5%. The method exhibited the advantages such as simple operation， low cost and short time， and operation value in emergency treatment and real-time environmental detection.

Keywords Mercury ion ； G-quadruplex； Spacer arm； Functional nucleic acid； Biosensor

（Received 5 November 2017； accepted 8 March 2018）