核盤菌分枝酸變位酶同源效應(yīng) 蛋白啟動子的克隆及功能分析

常 雪，盛寅生，任愛芝，趙培寶

(1.聊城大學 植物保護系，山東 聊城 252000；2.聊城市林業(yè)局，山東 聊城 252000)

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)屬于子囊菌(Ascomycetes)，核盤菌科(Sclerotiniaceae)，核盤菌屬(Sclerotinia)[1]，是一種寄主范圍廣泛的植物病原真菌，能侵染油菜、向日葵、豆科、葫蘆科、茄科蔬菜等400多種植物，引起菌核病[2]。菌核在核盤菌整個生活史中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，一般情況下，菌核會在被侵染的組織內(nèi)部產(chǎn)生，多數(shù)會在莖的髓部，當然在高濕情況下也可能在發(fā)病組織表面產(chǎn)生[3]。核盤菌對寄主的破壞性較大，在其致病過程中草酸和細胞壁降解酶發(fā)揮著重要作用[4-6]，而且核盤菌能夠產(chǎn)生活性氧并利用寄主過敏性壞死反應(yīng)來克服寄主防御、促進自身侵染[7-9]。隨著核盤菌全基因組序列的公布，核盤菌致病機制的研究開啟了新篇章，除了傳統(tǒng)的細胞壁降解酶、草酸等致病因子，人們也開始關(guān)注一些分泌性效應(yīng)蛋白在核盤菌與植物互作過程中的作用。例如Guyon等[10]通過分泌組分析找到了78個潛在的效應(yīng)蛋白候選對象，并對其中的16個分泌蛋白在不同植物中表達模式進行了分析；Lyu等[11]證明了一小分子效應(yīng)蛋白SsSSVP1能夠通過影響植物能量代謝，從而有利于自身侵染；Zhu等[12]研究了一分泌效應(yīng)蛋白SSITL能于侵染早期階段，在抑制茉莉酸介導的抗病過程中發(fā)揮作用。前期研究明確了分支酸變位酶同源效應(yīng)蛋白能夠提高核盤菌致病性。為了進一步探究其作用機制，對啟動子進行了克隆分析，旨在為進一步研究其表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

核盤菌(Sclerotinia.sclerotiorum)來自德克薩斯農(nóng)工大學 Prof.Dickman，M.B，GFP來自質(zhì)粒pBluntNAT-GFP1-1；潮霉素抗性基因hph來自質(zhì)粒 PUC-ATPH，引物：XS1-1：5′-GCAAGGAGGATCCTAATAG AATC-3′，XS1-2：5′-TCCCCCCGGGGTTGGGTGATTG AAG-3′；hph1：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTC-3′，hph2：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3′，由上海生工合成，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析效應(yīng)蛋白基因的上游序列 通過啟動子在線軟件Promoter 2.0和Promoter scan等對上游序列進行分析，以尋找基因的順式元件及啟動子。

1.2.2 效應(yīng)蛋白啟動子的PCR擴增 CTAB法提取核盤菌DNA，采用所設(shè)計的引物XS1-1和XS1-2經(jīng)PCR來擴增基因上游的啟動子序列。

1.2.3 啟動子的功能驗證 GFP融合載體的構(gòu)建：以pBluntNAT-GFP為基礎(chǔ)，插入真菌篩選標記潮霉素抗性基因，再將經(jīng)PCR克隆得到的啟動子(N-Pro)片段連入載體中，構(gòu)建得到啟動子+GFP融合載體，具體操作步驟如圖1所示：

轉(zhuǎn)化核盤菌：通過REMI介導的真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化核盤菌原生質(zhì)體，潮霉素篩選轉(zhuǎn)化子[13]。

圖1 載體構(gòu)建流程Fig.1 Construction of the vector

轉(zhuǎn)化子中GFP熒光檢測：采用熒光顯微鏡檢測獲得的轉(zhuǎn)化子菌絲GFP熒光表達狀態(tài)，來驗證啟動子功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子預測結(jié)果

經(jīng)過對基因上游大約2 000 bp的片段進行啟動子在線預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因上游區(qū)域-495--745 bp具有啟動子序列特征，-536 bp處有一個TATAbox結(jié)構(gòu)，-70--78 bp處含有CAAT box，這些是真菌啟動子所具備的啟動元件，因此，推測其上游區(qū)域具有啟動子功能，預測結(jié)果如表1所示。

表1 啟動子預測結(jié)果Tab.1 The result of the promoter prediction

2.2 啟動子的克隆與融合載體的構(gòu)建

2.2.1 啟動子的PCR擴增 采用CTAB法提取核盤菌DNA，利用引物XS1-1和XS1-2進行PCR擴增，獲得長度為733 bp的DNA序列(圖2)。

1.啟動子的DNA片段；M. DNA Marker DL2000。 1.The DNA of promoter；M.DNA Marker DL2000.

經(jīng)測序表明，本試驗得到分枝酸變位酶基因的上游序列，包含預測的啟動子元件，序列如圖3所示。

2.2.2 GFP融合載體的構(gòu)建 以pBluntNAT-GFP為基礎(chǔ)，插入真菌篩選標記潮霉素抗性基因，再將經(jīng)PCR克隆得到的啟動子(N-Pro)片段連入載體中，取代GFP自身所攜帶的啟動子，構(gòu)建得到啟動子(N-Pro)+GFP融合載體。

2.3 轉(zhuǎn)化子的篩選與驗證

將上述載體經(jīng)REMI介導的技術(shù)轉(zhuǎn)化核盤菌原生質(zhì)體，得到了能在含有潮霉素的PDA培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子DNA，以hph1-hph2為引物經(jīng)PCR驗證，擴增到了預期條帶(圖4)，表明載體已整合到轉(zhuǎn)化子基因組中。

圖3 啟動子DNA序列Fig.3 The DNA sequence of the promoter

1.對照；2-3.轉(zhuǎn)化子；M.DNA Marker DL2000。 1.CK；2-3.Transformations；M.DNA Marker DL2000.

2.4 啟動子+GFP的轉(zhuǎn)化子熒光表達分析

采用熒光顯微鏡分別對轉(zhuǎn)化子的菌絲和接種到煙草葉片的菌絲進行熒光檢測，菌絲中均檢測到了GFP熒光信號(圖5)，表明GFP能夠正常表達。本結(jié)果表明，克隆到的啟動子序列能夠啟動熒光蛋白表達，具有啟動子功能。

3 結(jié)論與討論

綜上所述，本試驗擴增到的分枝酸變位酶同源基因的上游733 bp的DNA序列能夠啟動GFP表達，具有啟動子功能。該啟動子的克隆為進一步研究該效應(yīng)蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

A.菌絲內(nèi)GFP熒光；B.煙草葉片中菌絲的GFP熒光；C.亮視野下的葉片。 A.The GFP fluorescence of the hyphae；B. The GFP fluorescence of the hyphae in the leaf of tobacco； C.The result in bright field of vision.

莽草酸途徑 (Shikimate pathway)是微生物和植物的基本代謝途徑，其終產(chǎn)物是分支酸 (Cho-rismate)[14]。分支酸是生物中許多化合物的前體，包括芳香族氨基酸 (如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)、水楊酸 (SA)、IAA及其他次生代謝物[15]。

分支酸變位酶 (Chorismate mutase，CM)催化分支酸轉(zhuǎn)化成預苯酸，為苯丙氨酸與酪氨酸的合成提供前體，從而改變分枝酸進一步轉(zhuǎn)化路徑，影響體內(nèi)水楊酸的水平及其植物抗性水平[16]。對于寄生性的病原微生物來講，其所需要的苯丙氨酸和絡(luò)氨酸可以從寄主獲得，分枝酸變位酶對于自身氨基酸代謝可能并不是必需的。但通過NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast發(fā)現(xiàn)，該類基因在部分真菌如黑粉菌(Ustilagomaydis)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)等的部分病原微生物體內(nèi)存在，推測可能在植物病原菌與植物的聯(lián)系中發(fā)揮作用。研究也證明，在專性寄生的黑粉菌中分枝酸變位酶基因Cmu1與其致病性密切相關(guān)，侵染后水楊酸水平顯著下降[16]。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，在死體營養(yǎng)的病原物中僅核盤菌具有分枝酸變位酶同源基因，前期研究表明，該基因與致病性相關(guān)，但對其如何發(fā)揮作用還不清楚。核盤菌與灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)致病機制類似，屬于一種死體營養(yǎng)的病原真菌[17]，通常認為，植物對死體營養(yǎng)病原物的抗性過程中水楊酸通路并不發(fā)揮主要作用[18]。水楊酸途徑可能是核盤菌侵染的操縱目標，一系列結(jié)果表明了水楊酸途徑也參與了植物與死體營養(yǎng)真菌的互作[19]。通過擬南芥各類激素突變體的抗性分析發(fā)現(xiàn)，核盤菌誘導抗性信號主要由茉莉酸和脫落酸誘導，但不依賴水楊酸信號途徑[20]。但是核盤菌接種12 h內(nèi)水楊酸途徑被激活，隨后在接種24 h后茉莉酸途徑被激活，這些結(jié)果證明了油菜抗核盤菌與相繼激活水楊酸途徑和茉莉酸途徑有關(guān)[21]。

前期研究表明，核盤菌分枝酸變位酶同源基因與致病性密切相關(guān)，對于其在致病過程中如何發(fā)揮作用值得進一步探究。通過對其啟動子進行克隆，來進一步探究該效應(yīng)蛋白的表達調(diào)控以及在與植物互作過程中的作用機制。下一步將通過酵母單雜交分離與該啟動子作用的反式因子，進一步研究其表達調(diào)控機理，為其作用機制研究提供幫助。