豬TAK1基因的cDNA全長克隆、 時空表達及亞細胞定位分析

李 瑞，徐海霞,2，吳 偉，王素瑩，任夢可，張朋朋,2，徐永杰,2

(1. 信陽師范學院 生命科學學院，河南 信陽 464000； 2. 信陽師范學院 大別山農業(yè)生物資源保護與利用研究院，河南 信陽 464000)

轉化生長因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)是MEK(MAPK/ERK激酶)激酶家族成員之一，是細胞信號傳導通路上游重要的調節(jié)蛋白[1]。TAK1可被細胞因子、生長因子、激素、UV等刺激信號所激活，通過活化 JNK、p38 和 NF-κB 信號通路來參與調節(jié)細胞的自我更新、分化、存活和炎癥反應等重要生物學過程[2-5]。小鼠中敲除TAK1基因會導致胚胎死亡，表明TAK1在小鼠正常發(fā)育中起著關鍵作用[6-7]；組織特異敲除TAK1基因小鼠模型的研究，進一步揭示TAK1可以參與血管發(fā)育、角質細胞分化、造血細胞和肝細胞的存活、軟骨和免疫器官的發(fā)育等多個發(fā)育過程[3，8-11]。在骨骼肌生長發(fā)育中TAK1也起著重要的調控作用， 其在小鼠骨骼肌發(fā)育早期被激活并呈現(xiàn)較高水平的表達，主要通過活化p38 MAPK信號通路調節(jié)成肌細胞的增殖與分化[12-15]。而TAK1缺失的小鼠胚胎成纖維細胞中轉染導入MyoD基因也不能誘導分化為成肌細胞，進一步表明TAK1為成肌分化所必需[12]。此外，Ogura等[2]報道，TAK1對維持肌肉衛(wèi)星干細胞池和肌肉再生也發(fā)揮重要作用。TAK1是肌衛(wèi)星細胞的存活和增殖所必需的調控因子，它可以在肌衛(wèi)星細胞中激活JNK和 NF-κB信號通路， TAK1的缺失或失活會誘導肌衛(wèi)星細胞的氧化應激并通過壞死性凋亡引起自發(fā)的細胞死亡。因此，TAK1是一個影響動物骨骼肌成肌分化和肌肉再生的重要基因，把其作為豬肌肉生長和肌肉品質相關的候選基因進行研究，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。目前，有關豬TAK1基因的序列、表達模式以及結構功能等方面的研究還較少，本研究利用PCR和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends，cDNA末端快速克隆)技術克隆獲得了豬TAK1基因的cDNA序列全長，并對TAK1基因序列進行了生物信息學分析，同時利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測了TAK1基因在中外不同豬種(梅山豬與大白豬)背最長肌不同發(fā)育時期以及大白豬不同組織中的表達情況；利用瞬時表達系統(tǒng)將豬TAK1基因與GFP融合表達，通過激光共聚焦顯微鏡分析其亞細胞定位情況，旨在探討豬TAK1基因的結構與功能，同時也為下一步細胞水平的功能研究以及揭示其在豬肌肉生長發(fā)育中的調控作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 試驗豬為來自于華中農業(yè)大學精品豬場的純種大白豬和梅山豬，在相同飼養(yǎng)管理條件下飼養(yǎng)，采集7個不同發(fā)育時期的背最長肌(胚胎期65 d及出生后3，21，60，90，120，180 d，每個時期3頭母豬)，另外采集出生后120 d大白豬的大腦、心、肝、脾、肺、腎、胰腺、脂肪、骨骼肌、胃、小腸、卵巢、輸卵管、皮14個組織，各樣品采集后置于液氮中速凍，最后統(tǒng)一轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、TRIzol、RNA酶抑制劑、pMD19-T載體、質粒DNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、dNTP、DNA Marker、膠回收試劑盒、T4連接酶、限制性內切酶、SYBR Green Master Mix等分子生物學試劑均購自TaKaRa公司；SMARTerTMRACE cDNA kit、Advantage 2×PCR kit均購自Clontech公司；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基均購自Gibco公司；Fugene?HD轉染試劑購自Promega公司；DAPI購自碧云天公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 質粒菌株 pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-EGFP表達質粒由信陽師范學院動物分子生物學實驗室保藏，感受態(tài)細胞JM109購自Promega公司。

1.2 引物設計及合成

以人TAK1基因的cDNA(NM_145333.2 )為信息探針，利用NCBI網(wǎng)站Blast(BlastN)工具搜索獲取豬的TAK1基因EST 序列，然后用DNAStar軟件構建豬EST-重疊群 ，再以此序列為基礎利用Premier 6.0軟件設計分離豬TAK1基因cDNA全長的5′RACE、3′RACE、CDS區(qū)以及時空表達分析的引物(表1)，引物在南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 豬TAK1全長cDNA序列克隆和qRT-PCR分析的引物信息Tab.1 The PCR Primers used for full-length cDNA cloning and qRT-PCR analysis of porcine TAK1

注：下劃線表示添加的限制性酶切位點。

Note：The underlines are the sites of restriction enzyme digestion.

1.3 豬TAK1基因的cDNA克隆

1.3.1 RNA提取和反轉錄將凍存的樣品在液氮中迅速研磨成粉末，取100 mg組織樣用TRIzol法提取總RNA，用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。以提取的總RNA為模板，用PrimeScript TR Master Mix試劑盒以Oligo(dT18)為引物合成cDNA第一鏈，同時利用SMARTerTMRACE cDNA kit構建豬肌肉組織RACE cDNA文庫，具體操作按說明書進行 。

1.3.2 豬TAK1基因cDNA的克隆及測序 利用設計的豬TAK1基因CDS區(qū)引物，以反轉錄得到的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，反應體系為20 μL： cDNA 2 μL，rTaqDNA聚合酶0.1 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+) 2 μL，dNTP Mix(2 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 12.7 μL。PCR程序設置：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，36 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。以構建得到的RACE cDNA文庫為模板進行豬TAK1基因5′RACE、3′RACE擴增，反應體系為25 μL：ddH2O 17.3 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix(10 mmol/L) 0.5 μL，50×Advantage 2 ploymerase Mix 0.5 μL，RACE Ready cDNA 1.2 μL，通用引物UPM(10×)2.5 μL，3′RACE/5′RACE 引物0.5 μL。RACE PCR反應程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個循環(huán)。PCR目的產(chǎn)物回收后純化、克隆至pDM18-T載體，然后由測序公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)完成序列測定。

1.3.3 豬TAK1基因的序列分析 分析方法參照文獻[16]。首先，利用DNAStar軟件將克隆得到的豬TAK1基因CDS區(qū)序列及完整5′和3′序列拼接成全長cDNA；然后利用GENSCAN 在線軟件(http：//genes.mit.edu/GENSCAN. htmL)分析豬TAK1基因的開放閱讀框(ORF)和poly A位點，并利用EBI 的ProtParam 在線軟件(http：//www.expasy.org/cgi-bin/protparam)和NCBI在線工具CDD(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)對編碼的蛋白質進行預測分析；最后，應用DNAMAN軟件，對豬、牛、綿羊、人、恒河猴、大鼠、小鼠、兔、斑馬魚、爪蟾、火雞11個物種TAK1基因的氨基酸序列進行同源性比較分析，并通過分子進化樹軟件MEGA 7.0，基于NJ(Neighbour-joining)法構建11個物種的TAK1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap設置為1 000)。

1.4 熒光定量PCR分析

根據(jù)豬TAK1基因的CDS序列設計特異引物(表1)，以GAPDH為內參，采用SYBR Green法對豬TAK1基因在豬骨骼肌發(fā)育不同時期以及不同組織的表達量進行qRT-PCR分析。反應體系為20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板0.5 μL ，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，ddH2O 8.3 μL。反應在ABI 7300熒光定量PCR 儀上進行，反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)；溶解曲線，65 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃。2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量， SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析，One-way ANOVA法分析豬骨骼肌不同發(fā)育時期間的差異表達，t-test法分析不同豬品種間及不同組織間的差異表達。

1.5 真核表達載體pcDNA3.1-EGFP-TAK1 的構建、鑒定及轉染

用分別添加EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位點的上、下游引物擴增完整的豬TAK1基因CDS序列，然后將純化后的擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切后回收目的片段，并添加真核表達載體pcDNA3.1(+)-EGFP與T4連接酶，于16 ℃連接過夜，然后轉化至感受態(tài)細胞(JM109)，篩選陽性克隆并進行DNA測序驗證。將測序結果正確的菌液擴大培養(yǎng)，使用無內毒素質粒提取試劑盒提取pcDNA3.1(+)-EGFP-TAK1質粒。

將C2C12細胞接種至6孔板中，每孔加入2 mL無抗培養(yǎng)基，待細胞融合度達到30%～40%時，準備轉染；向滅菌的1.5 mL離心管中加入200 μL Opti-MEM，再向其中加入6 μL Fugene?HD轉染試劑，輕輕混勻，室溫孵育5 min；然后向混合液中加入1 μg pcDNA3.1(+)-EGFP-TAK1質粒，輕輕混勻，室溫孵育15 min；孵育結束后，將復合物逐滴加入到6孔板中，轉染48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，收集細胞并提取RNA。同時轉染的細胞經(jīng)4% 多聚甲醛固定后，用細胞通透液室溫通透細胞，再用DAPI染色，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP-TAK1在C2C12細胞中亞細胞定位情況。

2 結果與分析

2.1 豬TAK1基因的克隆及序列分析

以梅山豬骨骼肌5′RACE cDNA文庫和3′RACE cDNA文庫為模板，利用豬TAK1基因5′RACE特異引物和3′RACE特異引物分別進行PCR擴增，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，結果顯示，TAK1基因5′RACE有5條大于1 200 bp的條帶，3′RACE有1條較清晰的800 bp左右的條帶，將這6條帶純化回收后經(jīng)測序比對發(fā)現(xiàn)，5′RACE中1 249 bp的帶(圖1箭頭標示)為目的序列； 3′RACE的條帶大小為812 bp(圖1箭頭標示)，也與目的序列一致，并包含17 bp完整的poly A尾巴序列。以梅山豬骨骼肌cDNA為模板，用TAK1基因CDS區(qū)特異引物擴增該基因CDS全長，獲得了1 740 bp的CDS序列。然后利用序列重疊將1 249 bp 的5′RACE序列、812 bp的3′RACE序列以及1 740 bp的CDS序列拼接得到豬TAK1基因2 163 bp的cDNA全長，該序列編碼579個氨基酸，起始密碼子“ATG”位于9-11 bp處，有脊椎動物典型的“ANNATG” 起始序列，終止密碼子位于1 746-1 748 bp處，5′端非翻譯區(qū)較短只有8 bp，3′端非翻譯區(qū)有415 bp，末尾處有17 bp的 poly A尾巴序列，但目前未發(fā)現(xiàn)典型的“AATAAA”加尾信號(圖2)。將該序列提交到GenBank，登錄號為KU504629。

圖1 豬TAK1基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳圖 Fig.1 The electrophoresis of porcine TAK1 cDNA clone

利用EBI 的ProtParam軟件和NCBI在線工具CDD對豬TAK1編碼的蛋白質進行分析，結果顯示，豬TAK1蛋白是由579個氨基酸組成，分子質量為64.1 ku，理論等電點為6.02，屬于酸性蛋白；脂肪系數(shù)為71.12，總親水性平均系數(shù)(Grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.540，屬于親水蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為62.15，該蛋白不穩(wěn)定。對其結構進行預測分析發(fā)現(xiàn)該蛋白有人類的TAK1結構特點，具有催化絲氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1結構域，另外還有多個保守的ATP結合位點、A-loop結構域、TAB1(TGF-beta activated kinase 1)結合位點(圖3)。

利用GenBank數(shù)據(jù)庫已有的TAK1的氨基酸序列：NP_766276.1(小鼠，Musmusculus)、NP_001075064.1(牛，Bostaurus)、XP_004011316.1(綿羊，Ovisaries)、XP_010705919.1(火雞，Meleagrisgallopavo)、XP_006238028.1(大鼠，Rattusnorvegicus)、NP_003179.1(人，Homosapiens)、AFI35255.1 (恒河猴，Macacamulatta)、AAC14008.1(爪蟾，Xenopuslaevis)、AAT07829.1(斑馬魚，Daniorerio)、XP_002714631.1(兔，Oryctolaguscuniculus)，構建分子系統(tǒng)進化樹(圖4)。結果表明，豬TAK1的氨基酸序列同其他物種具有很高的同源性，與人、恒河猴、綿羊、牛、小鼠、大鼠、兔、火雞、爪蟾、斑馬魚TAK1的氨基酸序列同源性分別為98.8%，98.8%，98.8%，98.6%，98.4%，98.3%，97.9%，91.5%，90.0%，71.0%，表明TAK1蛋白在不同物種的進化中非常保守?；诎被嵝蛄械倪z傳進化樹分析可知，豬TAK1與人、恒河猴、綿羊、牛等哺乳動物聚為一類，具有更近的親緣關系，與爪蟾、斑馬魚等的親緣關系較遠。

方框為起始密碼子和終止密碼子；小寫字母為核酸序列，大寫字母為對應的氨基酸序列。 Framed letters indicate the initiation codon and termination codon; The lowercase and uppercase are nucleotide sequence and protein sequence respectively.

圖3 TAK1蛋白保守序列的生物功能預測 Fig.3 Prediction of biological function of TAK1 conserved sequence

圖4 基于氨基酸序列的TAK1基因系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.4 The phylogenetic tree of TAK1 gene drawn with its amino acid sequence

2.2 豬TAK1基因的時空表達分析

利用qRT-PCR方法分析TAK1基因在大白豬(瘦肉型商品豬種)和梅山豬(脂肪型本地豬種)不同發(fā)育時期背最長肌中的表達情況(圖5)，結果表明，TAK1基因在2個品種豬背最長肌發(fā)育過程中具有類似的表達趨勢，在胚胎期 65 d呈現(xiàn)最高的表達水平，隨著生長發(fā)育而呈現(xiàn)下調趨勢，并于出生后60 d表達量開始急劇減少，出生后180 d表達量達到最低；而同一時期品種間比較發(fā)現(xiàn)，TAK1基因在梅山豬各發(fā)育時期中的相對表達量均低于大白豬，其中出生后90 d，2個品種間差異不顯著，其他時期差異均達到顯著水平或極顯著水平。TAK1基因在不同品種豬不同發(fā)育時期的背最長肌中的差異表達，表明在豬肌肉發(fā)育過程中，TAK1基因發(fā)揮著重要的調控作用。

65.胚胎期65 d；3～180.分別表示出生后3，21，69，90，120，180 d；圖中含有相異小寫字母和大寫分別代表大白豬與梅山豬品種間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P< 0.01)。

65.The 65 days of prenatal development stage; 3-180.The 3, 21, 69, 90, 120, 180 days of postnatal stage; Bar with Different lowercase letter and uppercase letters indicate significantly Different between Large White and Mashan pigs at the level of 0.05 and 0.01 respectively.

圖5TAK1基因在豬背最長肌不同發(fā)育時期的表達
Fig.5ExpressionofporcineTAK1geneindifferentperiodoflongissimusdorsimuscledevelopment

此外，本研究還探究了TAK1基因在出生后120 d大白豬的大腦、心、肝、脂肪、背最長肌、胃、小腸、肺、脾、腎、胰腺、卵巢、輸卵管、皮14個不同組織中的表達情況(圖6)，結果表明，TAK1基因在豬中具有組織特異性，其中脾臟中表達量最高，大腦和卵巢中表達量較高，心、肺、腎、脂肪、胃、小腸、輸卵管、皮中表達量次之，肝和背最長肌中的表達量相對較低，胰腺中表達量最低。柱狀圖上方不同字母表示不同組織間差異顯著(P<0.05)。

柱形圖上方不同字母表示不同組織間差異顯著(P < 0.05)。 Different letters donate significant differences between Different tissues (P < 0.05).

2.3 豬TAK1 基因融合表達載體的構建及亞細胞定位分析

為確定相關基因表達的蛋白質在細胞中發(fā)揮功能的具體位置，構建綠色熒光蛋白(GFP)與豬TAK1基因的融合表達載體，采用細胞轉染技術將融合表達載體轉染至小鼠C2C12成肌細胞中，轉染48 h時效率最高，在激光共聚焦電子顯微鏡下觀察TAK1和GFP融合蛋白的分布情況(圖7)，結果顯示，融合蛋白僅在細胞質表達(綠色熒光)，說明TAK1基因所編碼的蛋白質定位于細胞質中。

淺色為融合蛋白，深色為DAPI；Bar = 25 μm。 Light colour is the fusion protein, deep colour is DAPI; Bar = 25 μm.

3 結論與討論

TAK1 作為MEK激酶家族的主要成員，在JNK、p38 和 NF-κB 等新報信號傳導通路上游發(fā)揮作用，可能對細胞的自我更新、分化、存活起著重要的調節(jié)作用。目前，有關TAK1功能的研究主要是以人、小鼠、果蠅等為模型[2，16-17]，在豬中鮮有報道。本研究成功地克隆得到豬TAK1基因的cDNA全長2 163 bp，編碼579個氨基酸，與人、小鼠等物種TAK1基因比對發(fā)現(xiàn)，氨基酸同源性在98%以上，說明該蛋白質比較保守。經(jīng)NCBI在線工具CDD對豬TAK1 蛋白進行保守結構分析，發(fā)現(xiàn)其在N端含有典型催化絲氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1結構域，而在該結構域內部還有TAB1(轉化生長因子活化蛋白激酶1 結合蛋白)結合位點和A-loop結構域。先前的研究表明，TAB1可以與TAK1持續(xù)地結合并激活其激酶活性，進而引起TAK1在A-loop上的絲氨酸自身磷酸化從而徹底激活TAK1的活性[18-20]，表明TAB1結合位點和A-loop結構域是TAK1的激活所必需的。這些保守的蛋白質結構域揭示了TAK1 在不同物種間行使的功能可能是一樣的。

本研究通過qRT-PCR技術探討了TAK1 基因在出生后120 d(成年期)大白豬14個不同組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)TAK1 基因在所檢測的組織中均表達，但表達量存在顯著差異，其在脾臟中表達量最高，在大腦和卵巢中也有較高表達，胰腺中表達量最低。豬TAK1的這種表達模式與人類、小鼠、比目魚等物種的類似[21-23]，即在脾臟、胸腺等免疫器官中高表達。先前的許多研究已證實TAK1 基因在免疫、炎癥反應及生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要功能[9-12]。TAK1 基因對于哺乳動物細胞應對各種外界刺激至關重要，它可通過特定的信號轉導途徑激活NF-κB等轉錄因子，從而對來自微生物病原體或細胞因子的刺激做出應答與調節(jié)[1，6]。TAK1 基因還能通過TGF-β信號通路在大腦發(fā)育過程中調控軸突生長和神經(jīng)元遷移[24-25]。TAK1 基因在不同組織中的差異表達，可能與其在不同組織中的功能不同密切相關。

TAK1 基因在豬背最長肌不同發(fā)育時期的表達結果表明，TAK1 基因在胚胎期65 d時特異的高表達，而出生后隨著生長發(fā)育表達量下調，與在小鼠骨骼肌中的表達情況是一致的[12]。胚胎期65 d是豬骨骼肌次級纖維形成的一個關鍵時期，該階段骨骼肌主要圍繞初級肌纖維周圍分化發(fā)育，次級肌管快速增加，胚胎期90 d之后肌纖維數(shù)目基本固定[26-27]。TAK1作為p38 MAPK信號通路的上游激活因子在成肌分化過程中起著關鍵調控作用，并且是IGF-1發(fā)揮肌源性作用所必需，沉默TAK1表達會抑制分化相關的p38 MAPK和Akt的激酶活性，進而抑制成肌分化[12-13]，TAK1基因在豬胚胎期骨骼肌中高表達說明TAK1在豬肌形成特別是次級肌纖維形成過程中發(fā)揮著重要作用。此外，TAK1可以在肌衛(wèi)星細胞中激活體JNK和 NF-κB信號通路，對維持肌肉衛(wèi)星干細胞池和肌肉再生也起著重要作用[2]，TAK1 基因在豬出生后表達量下調，可能與豬肌衛(wèi)星細胞在出生后急劇減少有關。而不同時期(特別是在胚胎期和出生后3 d)2個豬品種間相比，TAK1 基因在大白豬中的表達量均高于梅山豬，這可能與TAK1參與調控成肌分化以及次級纖維形成有關，體型較大的大白豬次級肌纖維數(shù)目顯著高于小型豬[28-29]，而豬的產(chǎn)肉量主要由肌纖維數(shù)目和大小決定，因此，大白豬與梅山豬相比有較強的肌肉沉積能力。TAK1 基因可能與這2個豬品種肌肉沉積能力的差異有關，但具體的機制還有待于進一步深入探討。

亞細胞定位是確定蛋白質功能的重要方法，本研究將構建pcDNA3.1(+)-EGFP-TAK1表達載體瞬時轉染C2C12 細胞后成功表達EGFP-TAK1融合蛋白，激光共聚焦結果顯示，TAK1蛋 白 主 要 在 細 胞 核 外 表 達，該 結 果 與TAK1 蛋白在細胞質中發(fā)揮其在多條信號轉導途徑充當激活因子的功能相一致。

本研究通過同源克隆和RACE 技術克隆得到了豬TAK1基因的全長，并且分析了該基因的序列特征、時空表達及亞細胞定位情況，為進一步研究其在動物肌肉發(fā)育中的作用機制奠定了基礎。