免疫親和柱凈化-UPLC-MS/MS 測定魚蝦肉中的3種氨基糖苷類抗生素

王 強(qiáng)，王旭峰，趙東豪，黎智廣，蔡 楠，關(guān)婉琪，黃 珂，李劉冬*

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室

（廣州），農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州），廣東 廣州 510300）

氨基糖苷類藥物（aminoglycosides，AGs）屬于廣譜類抗生素，其分子結(jié)構(gòu)由氨基糖與氨基環(huán)醇通過糖苷鍵連接而成，臨床上主要用于對革蘭氏陰性菌、綠膿桿菌等感染的治療，可有效抑制細(xì)菌的生長和繁殖[1-3]。在畜牧水產(chǎn)行業(yè)中，AGs常被添加到動物飼料或其他餌料中，用于預(yù)防疾病和促進(jìn)生長，其進(jìn)入動物機(jī)體后與動物組織有很強(qiáng)的親和力，殘留代謝時間較長[4-6]。耳毒性和腎毒性是AGs共有的毒副作用，會影響神經(jīng)傳導(dǎo)，引發(fā)菌群失調(diào)從而損害腸道的吸收。消費(fèi)者直接食用這類殘留超標(biāo)的動物食品會帶來潛在的危害。目前，我國農(nóng)業(yè)部、美國FDA和歐盟委員會等相關(guān)管理機(jī)構(gòu)對動物性食品中常用的氨基糖苷類抗生素都設(shè)置了殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[7-9]。因此，有必要建立準(zhǔn)確有效的檢測方法，從而進(jìn)一步加強(qiáng)該類藥物在動物性食品中的風(fēng)險隱患排查。

目前，AGs的殘留定量檢測主要依靠以液相色譜法為基礎(chǔ)的儀器分析法[10]。由于該類物質(zhì)極性大，易溶于水且與樣品基質(zhì)結(jié)合緊密，樣品提取后凈化難度大，現(xiàn)有的文獻(xiàn)方法多采用固相萃取技術(shù)，常用的有HLB[8,10,13]和WCX[14-15]等通用型固相萃取柱，但其專屬凈化效果不強(qiáng)，樣品基質(zhì)干擾嚴(yán)重，導(dǎo)致方法靈敏度差，回收率不穩(wěn)定。高玲等[1]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中5 種AGs類抗生素，樣品經(jīng)磷酸緩沖液（含50 mmol/L庚烷磺酸鈉）提取后，用HLB固相萃取進(jìn)行凈化；GB/T 21323—2007《動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》方法中樣品提取后，在提取液中加入一定量的七氟丁酸溶液，經(jīng)C18固相萃取柱凈化后上機(jī)測定；這些方法引入了離子對試劑，會造成質(zhì)譜檢測器信號抑制和離子源的污染。

相比于傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)，免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC）凈化是通過抗原抗體之間特異性的分子識別而建立的分離萃取技術(shù)，具有特異性好、凈化徹底和樣品富集效率高等優(yōu)點(diǎn)，可以從復(fù)雜的待測樣品中有目的地捕獲提取目標(biāo)物[16-18]。研究表明，樣品經(jīng)IAC凈化后無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度高，無需采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測結(jié)果，凈化效果顯著優(yōu)于HLB和C18等通用型固相萃取柱，且使用后的IAC可用緩沖液平衡再生，重復(fù)利用率高[19-21]。而進(jìn)一步推進(jìn)IAC在復(fù)雜基質(zhì)樣品前處理中的推廣應(yīng)用，是目前獸藥多殘留檢測的熱點(diǎn)[22-23]?，F(xiàn)有的AGs類IAC主要是單一型柱，即一次測定一種藥物含量，李哲等[24]以四甲氧基硅烷為柱載體制備IAC，該柱對慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品的回收率均大于60%，可重復(fù)使用5 次。鄭琦等[25]以新霉素多克隆抗體為配基制備IAC，用高效液相色譜測定南美白對蝦中新霉素，所制備IAC的最大柱容量為2 182 ng/mL，該柱可重復(fù)使用5 次，并于4 ℃貯存110 d，性能良好。而目前可應(yīng)用于安普霉素（apramycin，APR）和卡那霉素（kanamycin，KAN）樣品凈化處理的IAC國內(nèi)尚鮮見報道。本研究制備了復(fù)合型IAC，其可以同時保留慶大霉素（gentamicin，GEN）、KAN和APR，樣品提取液經(jīng)IAC凈化后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析測定，建立一種快速、簡便、高效測定魚蝦肉中3 種AGs的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚蝦樣品由農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）提供。

CNBr-Sepharose 4B溴化氰活化瓊脂糖凝膠（46～165 μm） 美國GE Healthcare公司；GEN、KAN、APR、鏈霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素、大觀霉素、阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞92%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientic公司；Na2EDTA 廣州化學(xué)試劑廠；GEN、KAN、APR多克隆抗體為本實驗室自制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQS超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源及Masslynx數(shù)據(jù)處理軟件） 美國Waters公司；5810型臺式離心機(jī)德國Eppendorf公司；MS3旋渦混合器 德國IKA公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國Millipore公司；N-EVAP-111型12位氮吹儀 美國Organomation公司；24通道固相萃取裝置 美國Phenomenex公司；UV-1601紫外-可見分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

AGs標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取適量AGs標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈-水（1∶9，V/V）溶解并稀釋成質(zhì)量濃度均為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置于塑料離心管中4 ℃避光保存。使用時用乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶1，V/V）配成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，0.01 mol/L，含0.01% NaN3）：分別稱取KH2PO40.2 g、NaCl 8 g、Na2HPO4·12H2O 2.9 g、KCl 0.2 g，加水溶解定容至1 000 mL。

混合提取試劑（含0.4 mmol/L EDTA和2%三氯乙酸溶液）：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀1.36 g，用980 mL水溶解，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH 4.0，分別加入Na2EDTA 0.15 g和三氯乙酸20 g，溶解并定容至1 000 mL。

1.3.2 IAC的制備

參照CNBr-Sepharose 4B產(chǎn)品說明書并略有改變，具體操作步驟如下：

洗滌：于玻璃燒杯中準(zhǔn)確稱取CNBr-Sepharose 4B干粉1.0 g，加入5 mL HCl溶液（1 mmol/L），攪拌溶脹后轉(zhuǎn)移至G3砂芯漏斗上，用200 mL HCl溶液（1 mmol/L）充分洗滌，進(jìn)一步用200 mL NaHCO3溶液（pH 8.3，0.1 mol/L）洗滌平衡。

偶聯(lián)：將上述濕膠轉(zhuǎn)移至玻璃燒杯中，分別加入1.5 mL GEN抗體（4.6 mg/mL）、1.2 mL KAN抗體（5.8 mg/mL）和3.0 mL APR抗體（2.3 mg/mL），室溫下緩慢攪拌2 h后于4 ℃反應(yīng)過夜，使抗體與凝膠充分偶聯(lián)。隨后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗上，收集流出液體，進(jìn)一步用約30 mL上述NaHCO3溶液洗去未與凝膠偶聯(lián)的抗體，紫外分光光度計（280 nm）測定流出液和洗滌液中未偶聯(lián)蛋白含量，計算反應(yīng)偶聯(lián)率。

封閉：先用10 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，0.1 mol/L）在砂芯漏斗洗滌上述凝膠，隨后將全部凝膠用10 mL Tris-HCl緩沖液轉(zhuǎn)移至燒杯中，4 ℃封閉2 h。

平衡：用25 mL醋酸鹽緩沖液（pH 8.0，0.1 mol/L）和20 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，0.1 mol/L）交替沖洗平衡上述凝膠。

裝柱：取6 支3 mL的固相萃取空柱，每個柱子裝填0.5 mL上述濕膠，上端加裝篩板后注入適量的PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）于4 ℃密封保存。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY BEH Amide柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.30 mL/min；流動相：乙腈（A）和0.05%甲酸溶液（B）。梯度洗脫程序：0～2.5 min，95%～20% A；2.5～4.5 min，20% A；4.5～5.5 min，20%～95% A；5.5～7.0 min，95% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；脫溶劑氣溫度：600 ℃；脫溶劑氣流量：750 L/h；碰撞氣流速：0.15 mL/min，錐孔反吹氣流量：150 L/h；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測，定性及定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 3 種化合物的MRM離子對及質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 MRM transition and mass spectrometric parameters for the 3 analytes

1.3.4 樣品提取與凈化

準(zhǔn)確稱取已充分均質(zhì)的魚蝦肉樣品[26]2.0 g于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入20 mL混合提取試劑，渦旋振蕩提取10 min，4 000 r/min離心5 min。取10 mL上清液于另一干凈離心管中，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品溶液pH 7.5左右，加入10 mL PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）。IAC預(yù)先用15 mL PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）平衡后，將上述樣品提取液以每秒1～2 滴的速率通過IAC，上樣結(jié)束后用5 mL PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）和5 mL水沖洗IAC，擠干柱內(nèi)液體，用4 mL 0.1%甲酸-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于45 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶1，V/V）溶解并定容，經(jīng)0.2 μm濾膜后供UPLCMS/MS分析。

1.3.5 方法驗證

將GEN、KAN和APR的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶1，V/V）分別配制成質(zhì)量濃度為80～500、20～500 μg/L和20～500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)y，獲取相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。在空白樣品中添加低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.4節(jié)方法處理后上機(jī)測定，記錄保留時間和峰面積，以信噪比RSN≥3和RSN≥10分別確定方法的檢出限及定量限。

稱取空白魚肉和蝦肉樣品，分別添加相當(dāng)于80、200 μg/kg和400 μg/kg含量水平的GEN標(biāo)準(zhǔn)工作液，20、50 μg/kg和100 μg/kg含量水平的KAN和APR標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混勻后于室溫下靜置30 min。每個質(zhì)量濃度水平制作6 個平行樣品，按1.3.4節(jié)所述方法處理，外標(biāo)法定量，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.3.6 樣品測定

從2016—2017年度廣東省水產(chǎn)品例行監(jiān)測樣本庫（水產(chǎn)批發(fā)市場或超市所采集）中，抽取草魚8 份、鯽魚6 份、鱸魚4 份、烏鱧5 份、鱖魚5 份和南美白對蝦12 份，經(jīng)1.3.4節(jié)方法處理后進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Waters Masslynx 4.1軟件對UPLC-MS/MS所采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行積分處理，并導(dǎo)出色譜圖，其他數(shù)據(jù)和圖譜經(jīng)OriginPro 8.5繪圖軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件選擇結(jié)果

選擇電噴霧離子源正離子模式，對AGs的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行IntelliStart掃描，對毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣溫度和碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。AGs類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個氨基和羥基，極性大，親水性強(qiáng)，在普通的反相C18色譜柱上難以保留，往往需要在流動相中添加七氟丁酸或三氟乙酸等離子對試劑實現(xiàn)色譜分離。本研究選用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，其柱體的鍵合固定相是基于亞乙基橋雜化（BEH）顆粒的三鍵鍵合酰胺基（Amide），屬于親水作用液相色譜柱，流動相初始比例可以保持在95%的有機(jī)相，水相中無需添加其他鹽或離子對試劑等改性劑增加目標(biāo)物的保留效果，非常適合于分離高極性的化合物[27-28]。

圖1 3 種AGs（200 μg/L）的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of a mixed standard solution (200 μg/L)of the three AGs

流動相比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸溶液和乙腈-甲酸溶液，其中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.01%～0.5%。結(jié)果表明，水相單純使用水時，AGs幾乎不出峰，而水相中僅添加0.01%甲酸，色譜峰形有明顯的改善，甲酸的添加有助于質(zhì)譜的正電離，但此時目標(biāo)峰形較寬；當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.05%時，3種AGs的峰形尖銳，進(jìn)一步增加甲酸含量，目標(biāo)物的峰面積響應(yīng)值反而有所降低。使用乙腈洗脫的效果顯著優(yōu)于甲醇，向水相中添加不同濃度的乙酸銨（5～50 mmol/L），結(jié)果目標(biāo)物的保留時間和峰形沒有顯著的變化。如圖1所示，在0.05%甲酸溶液-乙腈流動相體系下進(jìn)行梯度洗脫，3 種物質(zhì)峰響應(yīng)值高且峰形尖銳對稱，保留時間穩(wěn)定，滿足定量分析檢測的要求。

2.2 IAC性能的測定和IAC條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 抗體偶聯(lián)率測定結(jié)果

瓊脂糖凝膠是制備IAC最常用的柱體基質(zhì)，其依靠糖鏈之間的次級鏈維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有相對穩(wěn)定的生物化學(xué)性質(zhì)[18]。商業(yè)化的CNBr-Sepharose 4B具有良好的親水性且易于活化，1 g CNBr-Sepharose 4B干粉可以溶脹獲得約3.5 mL濕膠。研究表明每毫升溶脹的凝膠與4～10 mg抗體偶聯(lián)可以獲得性能優(yōu)良的IAC[29-30]。本實驗向反應(yīng)液中投入約21 mg的抗體總量，即每毫升膠體與大約6 mg的抗體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，通過測定反應(yīng)流出液和洗滌液中蛋白含量，測得抗體與凝膠的偶聯(lián)率為91.8%。每個IAC（0.5 mL）中的單個抗體絕對質(zhì)量約為0.91 mg。

2.2.2 柱容量的選擇

柱容量是影響IAC性能的重要指標(biāo)，通過向IAC加載過量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算過柱前后目標(biāo)物質(zhì)含量的差異，計算IAC柱容量。取20 mL質(zhì)量濃度為100 ng/mL的AGs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，緩慢地加載至IAC上，檢測上樣液中漏穿的目標(biāo)物質(zhì)含量X。柱容量/（ng/mL）=（2 000-X）/0.5，其中，2 000為加載至IAC上單個物質(zhì)的絕對質(zhì)量/ng，0.5是單個IAC凝膠的體積/mL。結(jié)果表明，GEN、KAN和APR的IAC容量分別為1 127、1 368、925 ng/mL，而針對鏈霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素、大觀霉素和阿米卡星等其他氨基糖苷類物質(zhì)則無保留。

2.2.3 洗脫液及其體積的選擇

取10 mL質(zhì)量濃度為20 ng/mL混標(biāo)上樣，分別采用80%、90%、100%甲醇溶液作為洗脫液，洗脫體積均為10 mL，考察3 種AGs的回收率。結(jié)果表明，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，回收率不斷增加，當(dāng)使用純甲醇洗脫時，3 種物質(zhì)的回收率保持在80%左右?？赡苁怯捎贏Gs水溶性極強(qiáng)，僅使用有機(jī)溶劑無法將其從IAC上徹底洗脫，因此本研究嘗試降低洗脫液的pH值，分別采用0.1%甲酸-甲醇溶液和1%甲酸-甲醇溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖2所示，使用0.1%甲酸-甲醇溶液洗脫時3 種AGs的回收率為90.5%～94.1%，而使用pH值更低的1%甲酸-甲醇溶液洗脫時回收率并沒有進(jìn)一步提高。收集0.1%甲酸-甲醇溶液的洗脫液（1 mL/管），上機(jī)測定洗脫液中的目標(biāo)物質(zhì)含量，結(jié)果顯示洗脫液第4管里目標(biāo)物質(zhì)的含量已經(jīng)很低，前4 管洗脫液里3 種AGs總量的回收率均大于90%，為節(jié)約下一步氮?dú)鉂饪s的時間，并降低過多溶劑對IAC容量的破壞，洗脫液體積選擇4 mL。

圖2 不同洗脫條件下AGs的回收率（n=3）Fig. 2 Recoveries of AGs (200 ng) under different elution conditions (n = 3)

2.2.4 IAC穩(wěn)定性

圖3 IAC容量的變化Fig. 3 Variation in the AG adsorption capacity of the IAC column after repeated use

將所制備的IAC在20 d內(nèi)連續(xù)使用10 次，每隔2 d使用一次，每一次洗脫后用PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）再生后于4 ℃密封保存，計算柱容量和回收率的變化。結(jié)果表明（圖3），隨著IAC的多次使用，3 種物質(zhì)的柱容量隨之不斷下降，使用10 次后柱容量下降至392～445 ng/mL，柱容量整體下降了約60%，此時按照1.3節(jié)方法條件處理時回收率仍可以達(dá)到88.3%～96.6%。在實際樣品測定中，如果待測樣品中目標(biāo)物含量較高，可將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笥糜贗AC凈化處理，依然可以滿足檢測需求。同時，本研究結(jié)果表明，將IAC置于4 ℃密封保存1～6 個月，其柱容量沒有明顯的變化，3 種AGs的回收率大于90%。

2.3 線性方程、檢出限及定量限結(jié)果

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification for the AGs

由表2可知，GEN在80.0～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，KAN和APR在20～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。在空白樣品中分別添加AGs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3節(jié)方法處理，以3 倍和10 倍信噪比計算出方法的檢出限和定量限，分別為10～40 μg/kg和20～80 μg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度結(jié)果

由于待測物質(zhì)具有較高的水溶性和質(zhì)子化傾向，易與組織成分結(jié)合或被玻璃器皿吸附，在整個樣品前處理過程均需要采用聚丙烯塑料類容器?；旌咸崛∫褐泻?%的三氯乙酸溶液用于除去大部分的蛋白，提取液經(jīng)NaOH溶液調(diào)至中性后加入等體積的PBS（pH 7.4，0.01 mol/L），進(jìn)一步用IAC對其凈化。每個添加水平重復(fù)5 次，計算平均回收率和精密度。結(jié)果表明（表3），魚肉基質(zhì)中3 種目標(biāo)待測物的平均回收率為71.7%～96.8%，RSD為5.2%～8.8%；蝦肉基質(zhì)中目標(biāo)待測物的平均回收率為75.8%～96.4%，RSD為4.2%～10.9%。方法準(zhǔn)確度和精密度良好，滿足水產(chǎn)品中3 種AGs殘留檢測的要求。

表3 魚肉和蝦肉中AGs的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precisions for the AGs in spiked fi sh and shrimp (n= 6)

2.5 實際樣品測定結(jié)果

采用所建立的方法測定了廣東省內(nèi)的水產(chǎn)批發(fā)市場或超市的40 批次魚蝦類樣品，未檢出GEN、KAN、APR 3 種AGs殘留。

3 結(jié) 論

本研究制備了一種復(fù)合型IAC，其針對GEN、KAN、APR的柱容量分別為1 127、1 368、925 ng/mL，洗脫液選用4 mL 0.1%甲酸-甲醇溶液。IAC于20 d內(nèi)連續(xù)使用10 次后，柱容量下降至392～445 ng/mL，但回收率沒有明顯的變化，有效期為6 個月。魚蝦肉樣品用磷酸鹽緩沖液提取，提取液經(jīng)IAC凈化后選用親水性的BEH Amide色譜柱分離待測的物質(zhì)。該方法操作簡便，靈敏度高，雜質(zhì)干擾少，能夠較好地滿足魚蝦中3 種AGs殘留檢測的需要。