付楠 王平勇 魏萌涵 解慧芳 劉金榮
摘 要: 黃瓜花葉病毒 (CMV)是一種嚴重危害辣椒生產的病毒,抗黃瓜花葉病毒育種是辣椒育種的主攻目標之一。經過多年攻關,我國篩選鑒定出一批抗病種質資源,但仍存在抗源材料遺傳背景狹窄、抗性不高、轉育難等問題。隨著現代分子技術的快速發(fā)展,利用分子標記、基因組學、生物信息學、基因工程等手段,可以加深對抗性遺傳規(guī)律的認識,結合分子標記輔助選擇的方法,提高育種效率。從辣椒上黃瓜花葉病毒的株系劃分、種質資源的篩選鑒定、抗病遺傳規(guī)律和基因定位研究、抗病品種選育、病害防治方面介紹了辣椒抗黃瓜花葉病毒的研究進展,以期為深入研究辣椒抗CMV和抗病育種提供參考。
關鍵詞: 辣椒;黃瓜花葉病毒 (CMV);種質資源;抗病育種;病害防治
Abstract: Cucumber mosaic virus (CMV) seriously affects pepper production.The improvement of pepper resistance to CMV is one of the main breeding targets.After many years of efforts, a number of disease-resistant germplasm resources have been screened and identified. However, there are still some problems such as narrow genetic background, low resistance and the loss of resistance in the course of breeding. With the rapid development of modern molecular techniques, the use of molecular markers, genomics, bioinformatics and genetic engineering means, can deepen the understanding of the genetic law of disease resistance. The efficiency of breeding can be improved in combination of marker-assisted selection methods. This paper reviews on the research progress of resistance to CMV in pepper ragarding classification of CMV strains,screening of germplasm,genetic analysis and gene mapping,breeding of CMV-resistant varieties and disease control methods,in order to provide some reference for in-depth study of resistance to CMV and disease-resistant breeding.
Key words: Capsicum;Cucumber mosaic virus (CMV);Germplasm;Disease-resistant breeding;Disease control
黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus),寄主范圍極其廣泛,能侵染1 000多種單、雙子葉植物??山浹料x、種子傳播,給許多作物造成嚴重危害,如引起番茄的壞死、香蕉的花葉(心腐)、豆科植物的花葉、瓜類的花葉、西番蓮的死頂等[1]。
辣椒(Capsicum spp.)屬于茄科(Solanaceae)辣椒屬一年或多年生草本植物,營養(yǎng)價值高,維生素C含量居蔬菜之首,且食用方法多樣,是我國重要的蔬菜作物之一,年種植面積100多萬hm2。隨著辣椒栽培面積的不斷擴大,病毒病成為制約辣椒產量的重要因素,其中CMV在我國辣椒生產中檢出率最高,且危害嚴重,是我國辣椒病毒病的主要毒源之一。CMV侵染后,辣椒產生花葉、蕨葉、環(huán)斑、條斑或全株矮化、果實畸形等癥狀。一般年份造成辣椒減產20%~30%,流行年份甚至造成辣椒絕收。目前,病毒病的防治常采用傳統(tǒng)的藥劑防治法,但長期使用農藥不僅影響辣椒的產量和品質,而且污染環(huán)境,破壞生態(tài)平衡。因此,抗黃瓜花葉病毒育種一直是辣椒育種的主攻目標之一。傳統(tǒng)抗病育種方法耗時長,品種更替遠遠落后于病毒株系的變異,隨著現代分子技術的快速發(fā)展,了解抗病基因的遺傳規(guī)律、發(fā)掘抗病基因、利用分子輔助選擇和基因工程等手段選育抗性材料是解決辣椒CMV抗病育種最根本的途徑。
1 黃瓜花葉病毒
1.1 CMV的核酸組成
CMV為三分體病毒,由RNA 1、RNA 2、RNA 3 3個基因組和RNA 4亞基因組片段構成,常存在衛(wèi)星RNA分子[2]。RNA 1與RNA 2含有復制酶基因,分別編碼111 KD和97 KD蛋白質,決定著侵染寄主植物的癥狀表現、種傳以及對溫度的敏感性[3]。RNA 3通過RNA 4翻譯表達外殼蛋白(Coat Protein,CP)的遺傳密碼,從而決定了CMV蚜傳、電泳和血清學等性質,RNA 3編碼的運動蛋白(Movement Protein,MP)還與病毒在寄主細胞間的運動有關[4-5]。衛(wèi)星RNA是依賴病毒復制的小分子RNA,其在不同株系間高度同源但與基因組RNA無同源性,衛(wèi)星RNA很難從CMV中除去,大多數寄主上衛(wèi)星RNA能減輕CMV癥狀[6]。
1.2 CMV的株系劃分
一種病原物常常分化出若干種致病力不同的生理小種或株系,株系的鑒定和劃分對抗病毒病育種和病害防控具有重要意義。國外根據寄主癥狀、血清學關系和核苷酸序列同源性把CMV株系劃分成S和WT類群[7]。我國主要是以寄主癥狀和鑒別寄主反應來確定CMV株系,由于不同學者采用的鑒別寄主和測定條件不同,目前株系的劃分并不統(tǒng)一。田如燕等[8]將北京地區(qū)辣椒CMV劃分為重花葉株系、壞死株系、輕花葉株系和帶狀株系。楊秀榮等[9]選用6個有代表性的辣椒品種組成寄主鑒定譜,將北疆地區(qū)辣椒6個CMV分離物劃分為壞死落葉型、花葉型和輕花葉型。
為了能反映出病原病毒與品種抗性間的“基因對基因”關系,適于抗病育種的需要,提出了基因型株系的概念。楊永林等[10-11]篩選出5個對CMV抗性有明顯差別的辣椒品種組成基因型株系鑒別寄主譜,將代表全國6個省市的20個主要CMV分離物劃分為6個致病型明顯不同的株系群,并將吉林省的59個辣椒CMV分離物劃分為CMV-P0、CMV-Pl、CMV-P2、CMV-P3、CMV-P4株系;同時篩選出一套“致病型”株系鑒別寄主譜將吉林省的59個辣椒CMV分離物劃分為十字花科株系群,藜科株系群,茄科、葫蘆科株系群,豆科株系群,普通黃色花葉株系群。
也有研究根據抗原特性認為四川煙區(qū)的CMV株系主要屬于ⅠB亞組。Yu等[12]對我國不同地區(qū)不同年份采集的130多份CMV陽性樣品和核酸系列相似性,將其分為2個亞組(亞組Ⅰ和亞組Ⅱ),其中亞組Ⅰ進一步分為ⅠA 和ⅠB[13]。趙雪君等[14]依據病毒的CP基因序列合成引物,利用 RT-PCR技術進行檢測和鑒定,測定結果表明,亞組Ⅰ占93.1%以上,亞組Ⅱ占6.9%。
2 辣椒抗CMV的種質資源篩選
種質資源是遺傳育種的基礎,我國不斷加強辣椒抗CMV資源的引進和鑒定工作,篩選鑒定出一批抗病耐病的種質資源。
劉建華[15]從來自全國除臺灣和西藏以外的29個省市收集的1 322份辣椒資源中篩選到高度抗CMV材料29份。王述彬等[16]從154份國內辣椒種質資源中鑒定出11份抗CMV材料。毛愛軍等[17]從63份辣椒高代自交系中篩選到45份抗CMV材料。黃啟中等[18]從280份辣椒種質資源中鑒定獲得3份抗TMV或抗CMV的材料。林清等[19]從223份辣椒材料中篩選到27 份中抗CMV的材料。張曉敏等[20]從363 份供試材料中篩選出抗病材料2 份、中抗材料 124 份。李寧等[21-22]從國外引進的53 份辣椒種質中篩選出中抗CMV的材料6 份,之后又從283 份辣椒種質中篩選出抗CMV辣椒種質1 份、中抗28 份。
這些抗病材料對辣椒優(yōu)質種質研究具有重要價值,為培育抗病品種打下基礎,但是所獲得的抗病材料,免疫和高抗資源較少,兼抗幾種病的資源更少,所以搜集鑒定高抗資源或者通過多基因聚合技術獲得高抗和多抗育種材料是一個長期任務。
鄒學校[23]的研究表明,品種抗CMV能力與抗寒性呈正相關,起源于低溫地區(qū)的辣椒品種較抗CMV。劉建華等[24]研究表明,辣椒對CMV的抗性與辣椒素含量呈正相關,且對CMV的抗病性與對TMV的抗病性具有極顯著回歸關系。張曉敏[20]的研究表明,花期較晚和植株較矮的材料中,抗病性強的比率較高,且辣椒 CMV 的抗性也與辣椒種質資源的地理分布有一定的關系。這些研究結果為抗病材料的篩選鑒定和選育提供了參考。
3 抗病遺傳規(guī)律的研究
由于所用辣椒材料及CMV株系各異,不同的研究所得出的遺傳規(guī)律也存在差異。國外研究中,辣椒對CMV的抗性主要有3種結論:單隱性基因控制[25-26],單顯性基因控制[27],多基因控制[28]。
我國的研究結果相對統(tǒng)一,主要認為辣椒對CMV的抗性是多基因控制的不完全顯性遺傳。閻淑珍、于喜燕、姚明華等[29-31]的研究表明,辣椒對CMV的抗性受多基因控制,符合加性-顯性模型,且加性更顯著。鄒學校等[32]研究表明CMV抗性遺傳符合“加性-顯性”模型,F1代雜種抗性是純合的顯性基因決定的。吳小麗[33]發(fā)現辣椒苗期和成株期對CMV的抗性都是由兩對主基因控制的,但主基因間表現的作用有所不同,有的表現為加性-顯性-上位性作用,有的表現為加性-顯性作用。王興興[34]構建辣椒F2群體(Carolina Wonder×83-58)和重組自交系群體(83-58×Perennial),通過遺傳模型分析表明,F2群體對CMV的抗性符合加性-顯性-上位性基因遺傳模型,RIL(重組自交系)對CMV的抗性符合加性-顯性基因遺傳模型,且兩個群體的抗性都是由2 個主基因和多個微效基因控制。
4 抗CMV基因定位研究
Kang等[27]從Bukang辣椒栽培種中找到了一個單一顯性抗病基因命名為Cmr1,并將其定位在2號染色體上。我國大部分研究表明辣椒對CMV的抗性是由多基因控制的,且基因間常存在互作效應(表1)。
隨著測序技術的發(fā)展和辣椒基因組數據的公布,產生了比傳統(tǒng)圖位克隆和分離群體混合分析法更高效快速的定位技術,如QTL-Seq、MutMap法。
QTL-Seq適應于表型差異大的親本所構建的群體,選取分離群體中極端性狀的個體,分別構建DNA混池進行重測序,計算每個SNP位點的SNP指數(SNP-Index),根據兩混池SNP-Index的差值在染色體上的分布,得到QTL位置。目前,該方法已經在水稻、黃瓜、番茄、辣椒等多種作物上得到了應用。Guo等[38]利用QTL-Seq技術定位辣椒抗CMV基因,在抗感池之間定位到2個關聯(lián)區(qū)域,分別位于2號和11號染色體,并利用Indel標記(插入缺失標記)進而在2號和11號染色體關聯(lián)區(qū)間內分別定位到1 個主效QTL(qCmr 2.1)和1 個微效QTL(qCmr 11.1)。李寧等[39]構建F2群體,應用SLAF-seq技術對雙親及F2單株進行測序,構建了高密度遺傳圖譜,并應用MapQTL 5.0 軟件檢測到3 個與CMV抗性相關的QTL位點。
MutMap與QTL-Seq不同之處在于MutMap通常是用誘變得到的材料,而QTL-Seq可用自然存在的材料。梁發(fā)茂[40]用EMS(甲基磺酸乙酯)處理水稻秈稻品種‘ZS97,從M2中篩選出1份株高、穎花數和結實率與野生型差異明顯的突變株ZSXS,構建M3分離群體,遺傳分析確定突變性狀為單隱性基因控制,并利用MutMap方法將該基因定位于LOC_Os04g39430 位點。
5 抗CMV品種的創(chuàng)制
5.1 常規(guī)育種
傳統(tǒng)的辣椒育種方法有雜交、回交、測交、系統(tǒng)選擇等。黃啟中等[18]從280 份辣椒種質資源中鑒定獲得3 份抗TMV或抗CMV的材料,并分別采用雜交優(yōu)勢育種和回交轉育的方法,獲得了抗TMV(煙草花葉病毒)和CMV、性狀穩(wěn)定、品質優(yōu)良的育種新材料5 份。張寶璽等[41]利用2 個國外引進的2 個抗疫病的商業(yè)品種,通過系譜法選擇,獲得了6 個園藝性狀優(yōu)良的株系,其中有4 個株系兼中抗CMV和TMV,另有1個株系兼抗CMV。
5.2 分子輔助育種
分子標記輔助選擇已成為常規(guī)育種的重要輔助手段,利用連鎖標記可以快速鑒定抗病株,加快抗病品種選育的進程。王述彬等[42]利用F2群體,結合BSA分析法(混合群體分離分析法),發(fā)現ISSR標記I-34與辣椒抗CMV位點連鎖,遺傳距離為27.3 cM。楊學玲[43]利用AFLP標記,篩選出引物E18/M06與CMV抗性連鎖,連鎖距離為25.4 cM。Guo等[38]利用QTL-Seq技術檢測到兩個與辣椒抗CMV相關的QTL位點,其中主效QTL位點qCmr 2.1位于標記Indel-2-134和Indel-2-151之間,物理圖距為152.87~153.20 Mb;微效QTL位點qCmr 11.1位于標記Indel-11-31和Indel-11-73之間,物理圖距為21.14~23.19 Mb。
5.3 基因工程育種
隨著辣椒再生體系的建立,應用基因工程創(chuàng)制辣椒新品種的研究得以展開,主要包括外殼蛋白基因(CP)、運動蛋白基因(MP)和衛(wèi)星 RNA介導的抗性研究,其中導入CMV-CP目前較為成熟。
謝立波等[44]將CMV-CP 、TMV-CP基因轉入甜椒,對轉基因陽性植株進行加代、擴繁及篩選,獲得17 份穩(wěn)定抗病、高產材料,1份高抗材料。郭亞華等[45]將PBTC-8質粒上的TMV-CP和CMV-CP基因導入甜椒中,獲得的陽性轉化植株經接種鑒定為抗性,獲得1 份雙抗TMV和CMV轉基因甜椒材料。徐秉良等[46]的研究表明,成功轉化CMV-CP 和 TMV-CP的轉基因線辣椒‘陜 8212不僅能抗 CMV 和TMV 單獨侵染, 而且還能抵抗復合侵染。
陳青等[47]將CMV-MP和抗蚜蟲基因轉入辣椒內,并利用F2群體結合BSA法篩選到一個與辣椒抗蚜蟲基因連鎖的RAPD標記OPA18600,力圖通過提高辣椒抗病毒水平和減少病毒傳播載體來獲得高抗性的辣椒植株。
Kim等[48]將CMV衛(wèi)星RNA基因(互補DNA)導入辣椒,通過對轉基因植株后代的分子檢測及攻毒試驗,確認導入的基因能在轉基因植株后代中穩(wěn)定地表達和遺傳。董春枝等[49]用農桿菌將CMV衛(wèi)星RNA互補DNA導入辣椒,獲得轉基因植株,大部分轉基因植株CMV發(fā)生減慢,癥狀減輕。
6 辣椒CMV的傳播及防治
6.1 CMV的傳播途徑
辣椒病毒病可通過介體和非介體形式傳播,介體傳播是指各種蚜蟲、線蟲等引起的傳播,害蟲的發(fā)生量和遷飛活動影響辣椒病毒病流行的范圍和程度。非介體傳播指通過種子或病殘體的帶毒傳播,也包括農事操作造成的傳播。
CMV主要通過蚜蟲傳播,蚜蟲密度高,CMV的發(fā)病率也高。有利于蚜蟲生長繁殖的環(huán)境條件如高溫干旱天氣,不僅可促進蚜蟲傳毒,還會降低辣椒的抗病能力,加重黃瓜花葉病毒危害。同時氮肥施用過量導致植株營養(yǎng)生長較快,多茬連作,田間害蟲多發(fā)等條件下易使植株感病。
6.2 CMV的防治
辣椒病毒病的防治宜采取選用抗病品種為基礎,注重農業(yè)防治,及時消滅傳毒介體蚜蟲,化學防治為輔的防治策略。
6.2.1 種植抗病品種 不同的品種抗性不同,有研究表明早熟型辣椒品種病毒病較晚熟型品種輕,辣椒比甜椒抗病[50],因此選用抗病品種是預防CMV最經濟有效的方法,包括篩選鑒定的抗病品種和通過常規(guī)育種和植物工程、細胞工程等先進技術手段創(chuàng)制的抗病新品種。經過多年努力,我國培育出一批抗病品種,如湘研系列、中椒系列、遼椒系列、汴椒系列、吉椒系列、蘇椒系列等。
當前辣椒受多種病毒復合感染的現象普遍,導入一二種病毒殼蛋白基因帶來的垂直抗性是創(chuàng)制抗病品種的重要手段,但目前主要是針對辣椒上CMV和TMV進行育種,且垂直抗性不足以抵抗多種病毒的復合感染,加之新病原的出現和病毒的變異,使抗病品種及多抗品種的選育工作具有長期性和艱巨性。
6.2.2 農業(yè)防治 (1)種子消毒:對種子消毒有利于培育無病壯苗,能在一定程度上降低病毒病發(fā)生的可能性。(2)加強田間管理:適時播種,合理澆水施肥,勿偏施氮肥,促進辣椒生長,提高辣椒抗病性;合理密植,提高覆蓋率,抑制蚜蟲的活動范圍;避免連作,清潔田園,將前茬作物及病株帶出田間集中處理,減少菌源。(3)減少農事操作污染:規(guī)范農事操作,減少移栽、整枝、中耕、除草、采果等農事操作造成的病毒傳播。
6.2.3 物理防治 利用高桿植物設置屏障或建遮陽網進行遮光降溫,在辣椒田間覆蓋白色或銀色防蟲網,防止蚜蟲接觸植株,有效防止蚜蟲的侵害,也可利用蚜蟲趨向性特點,應用殺蟲燈、黃色板、性誘劑等趨避蚜蟲,這些防治方法成本低、易掌握、對環(huán)境無害,適宜推廣。
6.2.4 化學防治 對蚜蟲具有防治作用的化學藥劑有啶蟲脒、50% 避蚜霧可濕性粉劑、50% 馬拉硫磷乳油、30% 敵氧菊酯乳油等,這些藥劑對蚜蟲都具有較好防治效果。為避免病蟲害產生抗藥性,可將不同種類的藥劑交替輪換使用。有研究表明氨基寡糖素2% 水劑和其配制的葉面肥能夠很好地控制辣椒的病毒病,防治效果明顯高于對照,且對作物安全[51]。
6.2.5 生物防治 衛(wèi)星RNA可以干擾CMV的復制,從而降低CMV的濃度,減輕CMV癥狀。田波等[52-54]將CMV基因組RNA和衛(wèi)星RNA按1∶1的比例混合,接種到寄主植物上,選取無致病力的分離物,制成CMV生物防治制劑S51、S52,其在防治青椒CMV上其防病增產效果明顯,并被成功用于大面積防治辣椒病毒病。生防制劑還具有刺激植株生長,增強植株抗病性和促進果實成熟等作用。楊秀容等[55]研制的植物病毒抑制劑4號對辣椒上的CMV防治效果為40%,對提高辣椒坐果率,增加產量有顯著作用。
7 展 望
我國辣椒抗CMV研究雖取得了一定進展,但仍存在一些問題,如種質資源遺傳背景狹窄,免疫或高抗資源少,病毒株系劃分不統(tǒng)一,抗性遺傳復雜且多是數量遺傳不利于抗性轉育等。針對這些問題,還應繼續(xù)廣泛搜集、鑒定抗源材料,拓寬遺傳背景;深入研究遺傳規(guī)律,探索與抗病規(guī)律相符的育種方法,培育持久的、強抗性的辣椒新品種。近年來分子生物學技術發(fā)展迅速,高通量測序成本大幅下降,利用分子標記、基因工程等手段,有助于深入解析抗病機制和抗病規(guī)律,加快抗病育種進程,提高育種效率。
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