6株H9N2亞型禽流感病毒的分子演化和抗原變異分析

黃艷艷，李 悅,2，張 琳，王進(jìn)圣，吳福杰，吳家強(qiáng)*，劉思當(dāng)

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018； 3.山東鳳祥股份有限公司，陽谷 252300)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)可導(dǎo)致家禽和野鳥的禽流感[1-3]。據(jù)病毒兩種表面糖蛋白——血凝素(hemaglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)抗原性的不同，將禽源AIVs劃分為16種HA亞型和9種NA亞型。已知的HA和NA亞型均可在野鳥中分離到，因此普遍認(rèn)為野鳥是AIVs的天然宿主[4-5]。AIVs基因組由8個(gè) 獨(dú)立的基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)組成，病毒主要通過點(diǎn)突變和基因重組的方式發(fā)生變異，導(dǎo)致抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換[6-8]。

我國于1994年首次在廣東發(fā)病雞群中分離到H9N2亞型AIV[9]。該亞型AIV致病性低，早期感染易被忽視，在雞群中持續(xù)流行和傳播，成為國內(nèi)家禽的主要AIV流行亞型。該亞型病毒感染可引起雞呼吸道炎癥、免疫力下降和生產(chǎn)性能降低。感染雞群易并發(fā)或繼發(fā)其他疾病(如雞傳染性支氣管炎和慢性呼吸道病)，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率大幅增加。國內(nèi)預(yù)防家禽H9N2亞型禽流感的主要手段是疫苗免疫。血凝素蛋白是AIV重要的免疫保護(hù)性抗原，在疫苗免疫后雞體能夠產(chǎn)生相應(yīng)抗體，因此生產(chǎn)中普遍通過血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibitation test，HI)檢測(cè)雞血清抗體水平，評(píng)價(jià)疫苗免疫效果。

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，我國H9N2亞型AIV各基因隸屬于多個(gè)亞系，包括A/chicken/Shanghai/F/98-like亞系、A/Quail/HongKong/G1/97-like亞系、A/Duck/HongKong/Y280/97-like亞系和A/duck/HongKong/Y439/97-like亞系(表1，B～E)[10-11]。病毒8個(gè)基因片段重排頻繁，導(dǎo)致病毒基因型眾多[10, 12]。但是，自2010年以來G57基因型成為主要流行基因型。該基因型毒株最早于2007年分離自江蘇和江西的雞群， 2009年起迅速傳播開來[13]。本研究對(duì)2017年新分離自山東的6株雞源H9N2亞型AIVs進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化、分子特征和抗原性差異分析，旨在明確病毒的系統(tǒng)進(jìn)化狀態(tài)和抗原變異情況。

1 材料與方法

1.1 病毒、抗原和雞胚

6株H9N2亞型AIV毒株(表1)由本課題組分離、鑒定和保存。病毒于2017年2-4月分離自山東省聊城市一個(gè)發(fā)病肉雞場(chǎng)，分離方法如下。病料采集后經(jīng)研磨、離心、濾膜過濾和雙抗處理后接種9～11 日齡的SPF雞胚。雞胚培養(yǎng)96 h后收獲尿囊液，HA和HI試驗(yàn)驗(yàn)證病毒為H9亞型AIVs，擴(kuò)增HA和NA基因并測(cè)序，鑒定為H9N2亞型。將病毒保存于-80 ℃冰柜備用。血凝抑制試驗(yàn)用H9抗原來自疫苗生產(chǎn)用滅活抗原，由某疫苗公司提供；9～11日齡SPF雞胚，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.2 主要試劑

Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；PrimeScript One Step RT-PCR Kit為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司；pUC57載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海生物工程有限公司(Sangon)；IPTG (異丙基硫代-β-半乳糖苷)、X-gal (5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和氨芐青霉素購自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購自O(shè)XOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 RNA提取和RT-PCR

應(yīng)用Trizol法提取含毒尿囊液的總RNA，溶解于20 μL的TE緩沖液中。以RNA為模板，分別使用病毒8個(gè)基因片段的特異引物[14]進(jìn)行RT-PCR。采用25 μL反應(yīng)體系：RNase Free dH2O 5.5 μL，10×Buffer 12.5 μL，Prime Script RTase 0.5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.75 μL，Reverse Primer 0.75 μL RNA樣品 5 μL。循環(huán)參數(shù)：50 ℃反轉(zhuǎn)錄 30 min；94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序

取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，若電泳影像為單一目的大小的條帶，則采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收和純化擴(kuò)增產(chǎn)物；若電泳影像為包含目的片段的非單一條帶，則凝膠回收目的條帶，使用凝膠回收試劑盒純化目的基因。將純化的基因與pUC57載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。通過菌液PCR方法初步鑒定陽性質(zhì)粒，每個(gè)基因取3個(gè)陽性質(zhì)粒做雙向測(cè)序(上海華大基因有限公司)。

1.5 序列測(cè)定及分析

基因測(cè)序結(jié)果使用DNAStar的Lasergene v7.1軟件包進(jìn)行序列的翻譯(Editseq軟件)、編輯(Seqman軟件)、比對(duì)以及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)變異分析(MegAlign軟件)。通過NCBI Blastn搜索和下載各病毒基因的最相似序列(10～20條/基因)，與國內(nèi)H9N2亞型AIV各進(jìn)化分支的經(jīng)典參考序列一起，使用MEGA7.0軟件分別以Neighbor-joining(NJ)法和Maximum-likelihood法繪制各基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化分析所使用的基因ORF區(qū)域分別如下：PB2 1 418—2 272 bp、PB1 1 315—2 208 bp、PA112—1 209 bp、HA52—880 bp、NP89—1 453 bp、NA205—1 347 bp、M68—784 bp以及NS120—827 bp。

1.6 交叉血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)HA抗原性差異

分別使用本研究中的病毒分離株SD210、SD217和SD227抗原以及該養(yǎng)殖場(chǎng)使用的H9N2亞型疫苗株抗原制備4單位病毒，進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)(HI)，檢測(cè)和比較不同抗原與疫苗免疫雞血清(1 000份)的反應(yīng)性。

2 結(jié) 果

2.1 H9N2亞型AIV分離株的基因同源性分析

本研究獲得了6株H9N2亞型AIV的基因序列信息(GenBank登錄號(hào)見表1)。表1列出了6株病毒(A1～6)及其基因的GenBank登陸號(hào)，以及系統(tǒng)進(jìn)化分析使用的經(jīng)典參考毒株B～E。G57代表一株隸屬于G57基因型的H9N2參考毒株。

Pairwise-distance分析表明，6株分離毒株各基因的相似性在93.4%～100%(表2)。

表1本研究中的H9N2禽流感病毒分離株和經(jīng)典參考毒株

Table1H9N2AIVisolatesandclassicreferencevirusesinthisstudy

組別GroupH9N2 AIV毒株H9N2 AIV strain簡(jiǎn)稱AbbreviationHA效價(jià)HA titerGenBank登陸號(hào)GenBank accession No.A1A/chicken/ShanDong/210WZ/2017CK SD 210WZ 178MF795007～142A/chicken/ShanDong/217YY/2017CK SD 217YY 177MF795039～463A/chicken/ShanDong/227AC/2017CK SD 227AC 178MF795015～224A/chicken/ShanDong/306SZ/2017CK SD 306SZ 179MF795031～385A/chicken/ShanDong/321ZL/2017CK SD 321ZL 178MF795023～30

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

表2顯示了6株病毒分離株的基因型分類，分離株間的基因同源性(A)以及分離株和經(jīng)典參考毒株(B～E和G57)的基因相似性分析結(jié)果。其中，A為6株分離株，B為CK SH F 98，C為QL HK G1 97，D為DK HK Y439 97，E為DK HK Y280 97，G57表示一株G57基因型參考株，“-”表示該基因類型來源不明。

表2H9N2亞型禽流感病毒分離株基因型和基因相似性分析結(jié)果

Table 2 The result of genotype and genic homogenous analyses of H9N2-subtype AIV isolates%

表3列出了與H9N2分離株各基因相似性最高的部分參考毒株的基因信息。其中，病毒分離株1～6分別為CK SD 210WZ 17、CK SD 217YY 17、CK SD 227AC 17、 CK SD 306SZ 17、 CK SD 321ZL 17和CK SD 413ZDM 17。NCBI Blastn分析 表明，與各分離株基因同源性最高的參考序列主要來自2014年以來的病毒，基因相似性均在98%以上(表3)，其中，分離株HA和PA基因與A/duck/Japan/AQ-HE5/2015 (H9N2)相應(yīng)基因的相似性最高，分離株P(guān)B2、PB1、NA、M和NS基因分別與2016年來自江西贛州的幾株病毒相應(yīng)基因的同源性最高(表3)。這些參考株分離自包括山東、河北、上海、江蘇、浙江、江西、湖南、廣東和日本等在內(nèi)的廣泛地理區(qū)域。

2.2 H9N2亞型AIV分離株的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖1)，NJ法和Maximum-likelihood法構(gòu)建的進(jìn)化樹其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同，分離株8個(gè)基因片段均與G57基因型參考株處于同一進(jìn)化亞系。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1)和基因同源性分析(表2)的結(jié)果，以同一亞系內(nèi)基因相似性≥90%為劃分依據(jù)，發(fā)現(xiàn)病毒分離株的PB1、PA、NP和NS基因隸屬于CK SH F 98亞系，M基因?qū)儆赒L HK G1 97亞系，HA和NA基因可勉強(qiáng)劃分到DK HK Y280 97亞系(相似性處于90%臨界點(diǎn)附近)，而分離株P(guān)B2基因隸屬于一個(gè)與上述4個(gè)亞系平行進(jìn)化的亞系(表2)。

表3與本研究中分離株的基因同源性最高的參考毒株信息

Table3ReferenceviruseswithhighestgenicidentitiestotheH9N2genesinthisstudy

AIV基因片段AIV gene segment分離株Isolate基因相似性最高的病毒序列Ref. gene with top homology to isolate gene 相似性/%SimilarityPB21～6A/chicken/Shanghai/15/2015(H9N2)98.1～99.11～6A/chicken/Ganzhou/GZ140/2016(H9N2)98.1～99.1PB11～6A/chicken/Ganzhou/GZ188/2016(H9N2)99.3～99.6PA1～6A/chicken/Qingdao/017/2014(H9N2)98.5～98.81～6A/duck/Japan/AQ-HE5/2015(H9N2)98.3～98.5HA1～6A/duck/Japan/AQ-HE5/2015(H9N2)98.4～98.7NP1, 3～6A/chicken/Wenzhou/YHQL04/2014(H9N2)98.4～98.52A/chicken/Xigou/1/2011(H9N2)97.7NA1～2A/chicken/Ganzhou/GZ188/2016(H9N2)98.8～99.33～6A/chicken/Ganzhou/GZ86/2016(H9N2)98.9～99.0M1A/chicken/Shanghai/15/2015(H9N2)99.92～6A/chicken/Ganzhou/GZ188/2016(H9N2)99.2～99.6NS1～6A/chicken/Ganzhou/GZ86/2016(H9N2)98.9～99.2

2.3 H9N2 AIV分離株的分子特征分析

對(duì)分離株各基因的編碼氨基酸進(jìn)行預(yù)測(cè)分析表明，各基因編碼蛋白的長度與以往報(bào)道的H9N2病毒分離株一致。PB2、PB1、PA、NP、HA和NA蛋白的長度分別為759、757、716、560、498和466個(gè)氨基酸，基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2的長度分別為252和97個(gè)氨基酸，而非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2蛋白分別為217和121個(gè)氨基酸。HA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析表明，6株病毒HA基因裂解位點(diǎn)的氨基酸殘基均為RSSR↓GLF，符合低致病性AIV的分子特征(表4)。構(gòu)成HA上唾液酸受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸以及HA潛在糖基化位點(diǎn)的氨基酸高度保守，其中CK SD 227AC 17和CK SD 306SZ 17的HA有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(NX-T/S，X為除P以外的氨基酸),而其余4個(gè)分離株有5個(gè) 糖基化位點(diǎn)(表4)。

表4H9N2毒株HA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

Table4AnalysisofkeysitesofaminoacidresiduesofHAprotein(H9N2isolates)

病毒VirusHA裂解位點(diǎn)HA cleavage site 受體結(jié)合位點(diǎn)Receptor combination site潛在糖基化位點(diǎn)Potential glycosylation site10916116319119820220329-31141-143298-300305-307492-494551-553CK SD 210WZ 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SD 217YY 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SD 227AC 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTNGSCK SD 306SZ 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTNGSCK SD 321ZL 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SD 413ZDM 17RSSR↓GLFYWTNTLYNSTNVSNSTNVS NGTCK SH F 98RSSR↓GLFYWTNALYNSTNVSNTTNVS NGTNGSDK HK Y280 97RSSR↓GLFYWTNVLYNSTNVSNTTNVSNGTQL HK G1 97RSSR↓GLFYWTHELYNSTNVTNSTNVS NGTDK HK Y439 97ASNR↓GIFYWTHELYNSTNVTNTTNVS NGT

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

(接上頁 Continued)

顯示了H9N2亞型AIVs的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ法)。其中，本研究中的6株病毒分離株以圓點(diǎn)表示，4個(gè)經(jīng)典參考毒株(CK SH F 98、QL HK G1 97、DK HK Y439 97和DK HK Y280 97)以三角形表示，G57亞型參考株以矩形表示Fig.1 showed the phylogenetic trees of the 8 AIV genes (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M and NS). The 6 viruses labeled in circle were the isolates in this study. The 4 viruses labeled in triangle were classical reference viruses (CK SH F 98, QL HK G1 97, DK HK Y439 97 and DK HK Y280 97). The virus labeled in rectangular was a G57-genotype reference virus圖1 H9N2亞型AIV各基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic trees of genes of H9N2 avian influenza viruses in this study

與AIV抗藥性相關(guān)的蛋白位點(diǎn)分析表明，本研究中的6株H9N2分離株M2蛋白的第26—34位氨基酸殘基序列為LVVAANIIG，均存在S31N變異，表明病毒均對(duì)離子通道蛋白抑制劑耐藥[15]；分離株NA蛋白不存在R292K變異，表明病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感[16]。此外，分離病毒其他蛋白未見有對(duì)哺乳動(dòng)物模型致病性增強(qiáng)的單個(gè)氨基酸變異，如PB2蛋白的E627K變異和D701N變異、PB1-F2蛋白的N66S變異或NS1蛋白的D92E變異[17-20]。

2.4 AIV分離毒株的HA抗原性差異分析

對(duì)1 000份免疫雞血清進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)的結(jié)果表明，以分離株SD210為抗原比疫苗株抗原測(cè)得的免疫雞血清HI效價(jià)平均低2 log2； 而以分離株SD217和SD227為抗原比疫苗株抗原測(cè)得的血清HI效價(jià)平均低1～2 log2。表5顯示了其中20份血清的HI檢測(cè)結(jié)果。

表5分別以H9N2亞型病毒分離株和疫苗株為抗原的血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果

Table5ResultsofHItestswithH9N2isolatesorthevaccinevirusasantigenslog2

3 討 論

本研究對(duì)2017年上半年自山東省肉雞場(chǎng)分離到的6株H9N2亞型AIVs進(jìn)行了基因組序列測(cè)定、進(jìn)化分析和HA抗原性差異分析，為H9N2亞型AIVs的分子演化和抗原變異提供最新的流行病學(xué)資料。從病毒分離時(shí)間上來看，與分離毒株基因相似性最高(≥98%)的參考基因大多來自2014—2016年。相比之下，分離毒株與20世紀(jì)末分離的系統(tǒng)進(jìn)化經(jīng)典參考毒株相似性較低，其中PB2基因與4株參考株基因相似性均已低于90%，HA和NA基因與經(jīng)典株基因相似性最高者也僅90%左右(表2)。表明國內(nèi)H9N2病毒流行株不斷累積基因變異，與經(jīng)典株的基因分化不斷加劇。另外，從病毒基因型上來看，國內(nèi)H9N2亞型禽流感病毒基因型自2009年起多樣性驟減，G57成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)流行基因型[13]。本研究中的H9N2分離株在系統(tǒng)進(jìn)化分類上同屬于G57基因型，表明該基因型病毒繼續(xù)在山東省肉雞群中流行。

AIV的HA蛋白在合成之初以多肽HA0的形式存在，然后在適當(dāng)?shù)牡鞍姿饷傅淖饔孟铝呀鉃镠A1和HA2。含單堿性氨基酸裂解位點(diǎn)基序的HA蛋白僅能被特異性蛋白酶(如胰酶)所裂解，因這類酶在鳥類的分布局限在呼吸道和腸道，病毒感染后僅產(chǎn)生溫和或無癥狀感染；而另一方面，裂解位點(diǎn)為多堿性氨基酸的HA蛋白可被鳥體內(nèi)廣泛分布的泛素所裂解，從而導(dǎo)致病毒的廣泛復(fù)制和多器官感染[21-22]。本研究中分離株HA蛋白裂解位點(diǎn)基序的單堿基氨基酸表明，各病毒仍屬于低致病性范疇。

目前商品化的流感病毒藥物包括M2抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)和NA抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)[23]。M2或NA蛋白單個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異即可導(dǎo)致流感病毒的耐藥性。M2蛋白的L26I、V27I、A30P、S31N或G34E變異可導(dǎo)致AIV對(duì)金剛烷胺耐藥性[24]； NA蛋白R(shí)292K(以N2序列計(jì)數(shù))變異可導(dǎo)致N1、N2和N9亞型AIV對(duì)NA抑制劑的耐藥性[16, 25-26]。與耐藥性相關(guān)的AIV氨基酸位點(diǎn)分析表明，本研究中的6株H9N2分離株對(duì)離子通道蛋白抑制劑耐受，而對(duì)神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑敏感。

反向遺傳學(xué)研究表明，PB2蛋白的E627K突變可增強(qiáng)H5N1亞型AIV對(duì)小鼠的系統(tǒng)性感染，導(dǎo)致小鼠T細(xì)胞活化受損[27-28]；PB2蛋白的D701N突變是促進(jìn)H5N1亞型AIVs在豚鼠間傳播的必要條件[29]；NS1蛋白的D92E突變可增強(qiáng)H5N1亞型AIVs對(duì)豬的致病性[19]。此外，PB1-F2蛋白的N66S突變導(dǎo)致了H5N1/1997和H1N1/1918流感病毒毒株對(duì)人致病性的增強(qiáng)[30]。本研究中的6株分離株內(nèi)部蛋白均不存在上述氨基酸變異。

交叉血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果表明，本研究中的H9N2分離株HA蛋白抗原與現(xiàn)有HI用標(biāo)準(zhǔn)抗原略有差異。在養(yǎng)禽生產(chǎn)中，一般將交叉HI效價(jià)相差3 log2作為流行株抗原與疫苗株抗原有顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)此分析，本研究中的分離株與疫苗株抗原性差異尚不顯著。后續(xù)研究中我們將繼續(xù)對(duì)山東省H9N2亞型AIV分子演化和抗原變異進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，以積累病毒感染、傳播和進(jìn)化的數(shù)據(jù)，促進(jìn)AIV的有效防控。

4 結(jié) 論

2017年在山東省聊城市該肉雞場(chǎng)流行的6株H9N2亞型禽流感病毒仍然為G57基因型，病毒對(duì)離子通道蛋白抑制劑耐藥，病毒分離株的HA抗原反應(yīng)性與疫苗株差異不顯著。