5種血清微小核糖核酸在主動脈夾層患者中的表達(dá)變化及聯(lián)合診斷價值研究

蘆 潔 陳垚志 李玉琳 劉卓慧 馬 珂 王綠婭 杜 杰

表1 cDNA合成反轉(zhuǎn)錄特異引物序列

注：RT primer：反轉(zhuǎn)錄引物

主動脈夾層(aortic dissection，AD)是由于主動脈壁內(nèi)膜和中層撕裂，形成內(nèi)膜撕裂口，使中層直接暴露于血管腔，主動脈腔內(nèi)血液在動脈壓的驅(qū)動下，經(jīng)撕裂口直接穿透病變的中層，使中層分離而形成，是一種極為嚴(yán)重的大動脈疾病。其發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率高，若未及時救治，急性AD發(fā)生后48 h 內(nèi)，病死率高達(dá)50% ～68%，3個月內(nèi)病死率可達(dá)90%[1-2]。目前，AD的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)技術(shù)，但是臨床表現(xiàn)缺乏特異性，而影像學(xué)診斷往往不夠迅速，臨床現(xiàn)有生物標(biāo)志物中D-dimer應(yīng)用較普遍，敏感度很高但特異度較差[3]，AD初期誤診率高達(dá)25%～50%[4]。據(jù)文獻(xiàn)報道循環(huán)微小核糖核酸(microRNA)有作為心血管疾病生物標(biāo)志的潛能。因此，目前臨床急需一種生物標(biāo)志物可以提高AD診斷的靈敏度和特異性。根據(jù)過以往文獻(xiàn)報道篩選出5個生物學(xué)功能可能與AD病理機(jī)制相關(guān)且在血清中表達(dá)量較高microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)，本研究旨在探討這5個血清microRNA作為新型生物標(biāo)志物在AD診斷中的價值。

資料與方法

1.一般資料 選擇2015年9月至2016年3月期間在北京安貞醫(yī)院就診并最終確診為AD患者60例為AD組，其中男性45例，女性15例，平均年齡(51.95±11.47)歲。同時選取年齡性別匹配的在北京安貞醫(yī)院體檢顯示健康者60 例為對照組(HC組), 其中男44例，女16例，平均年齡為(52.28±9.88) 歲。AD診斷標(biāo)準(zhǔn)：基于超聲心動圖或主動脈CT血管成像檢查或者手術(shù)發(fā)現(xiàn)確診[5]。AD排除標(biāo)準(zhǔn)：AD患者伴隨有先天性心血管疾病、妊娠、系統(tǒng)性炎癥疾病、肝功能異常、腎功能異常、馬方綜合征、心力衰竭、腫瘤、冠心病者；創(chuàng)傷性或醫(yī)源性夾層；未接受影像學(xué)檢查(CT或TEE)；無入院D-dimmer檢測結(jié)果；無可用血清樣本。本研究經(jīng)北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組人員均簽署知情同意書。

2. 微小核糖核酸檢測 (1)血清收集與處理 抽取AD患者入院24h內(nèi)外周全血3mL，對照組常規(guī)采血，經(jīng)2 000g離心15min后取上清液于無RNA酶(RNase-free)EP管，分裝后置于-80℃低溫冰箱保存。所有樣本統(tǒng)一按照mirVana miRNA isolation 試劑盒說明書提取血清miRNA，為了防止RNA降解，在提取RNA前加入RNAlater。

(2)微小核糖核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA 采用Life公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配置為：2μL dNTP(2.5mM each)，2μL 10XRT Buffer，0.3μL RT特異引物(1μM)(表1)，200ng Total RNA，0.2μL MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)，0.3μL RNA酶抑制劑(40μ/μL)，20μL無RNA酶水。配置好體系后在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為16℃ 30min，42℃ 40min，85℃ 5min。反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用。

(3)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)擴(kuò)增cDNA 采用Life公司的qRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用Taqman HT7900熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃，10min；40個PCR循環(huán)(95℃，10s；60℃，60s)。反應(yīng)體系為8μL反應(yīng)體系(5 μL 2×Master Mix，0.5μL 10μmol/L的PCR特異引物F，0.5μL 10μM 的PCR特異引物R)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進(jìn)行-Ramp Rate為0.05℃/s)。

(4)血清microRNA表達(dá)量計(jì)算 各樣品中5個目的miRNA和內(nèi)參U6分別進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用2- △△ CT法計(jì)算5個microRNA在血清中的相對表達(dá)量。

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析計(jì)量資料正態(tài)性，計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(M)及四分位數(shù)間距(P25，P75)表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示,兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。5個microRNA血清相對表達(dá)量在兩組間的比較通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換后以散點(diǎn)圖展現(xiàn)。通過繪制受試者工作(ROC)曲線評價5個microRNA單獨(dú)或聯(lián)合對于AD的早期診斷價值，用邏輯回歸模型擬合多個microRNA的聯(lián)合診斷，根據(jù)約登指數(shù)確定截?cái)嘀担郧€下面積(AUC)、靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標(biāo)評價microRNA的診斷價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組間基線資料比較 HC組與AD組在年齡、性別、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、血脂水平、血糖水平和腎功能指標(biāo)比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AD組體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、D-二聚體(D-dimer)、C反應(yīng)蛋白(C-reaction)水平高于HC組(P<0.05, 表2)。其中BMI并未報道過與AD有關(guān)，D-dimer和CRP都是已知在AD中上升的因子，與既往報道一致，且與本文研究的5種microRNA無相關(guān)性。

表2 兩組間基線資料比較

2.兩組間5個血清microRNA表達(dá)水平比較 通過qRT-PCR方法檢測HC組和AD組中5個血清microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)的相對表達(dá)水平變化，兩組間比較結(jié)果顯示，與HC組相比，5個血清microRNA相對表達(dá)水平在AD組均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖1)。

3.ROC曲線分析單個血清microRNA區(qū)分兩組的診斷效能 ROC曲線區(qū)分AD組和HC組，5個血清microRNA的曲線下面積(AUC)均>0.7(P均<0.05)，其中has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p的AUC>0.9，分別為0.915(95%CI:0.862～0.968)、0.912(95%CI:0.862～0.962)和0.910(95%CI:0.860～0.960)，另外has-miR-21-5p和has-miR-223-3p的AUC分別為0.732(95%CI:0.642～0.822)和0.717(95%CI:0.618～0.815)，結(jié)果顯示5個血清microRNA均對AD組和HC組有較好的區(qū)分能力。為了發(fā)掘臨床潛在應(yīng)用價值，根據(jù)約登指數(shù)確定各microRNA 的截?cái)嘀?，同時分析靈敏度和特異度，這些指標(biāo)顯示5個microRNA均有較好的臨床診斷價值(圖2，表3)。

圖1 兩組間5個血清microRNA表達(dá)水平比較

圖2 單個血清5種microRNA區(qū)分兩組的ROC曲線 注：AUC：曲線下面積

4.ROC曲線分析聯(lián)合多個血清microRNA區(qū)分兩組的診斷效能 根據(jù)單個microRNA的ROC曲線分析，選出AUC>0.9的3個microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p)聯(lián)合為Signaturea，5個microRNA全部聯(lián)合為Signatureb，通過ROC曲線分析多個microRNA聯(lián)合對于區(qū)分AD組和HC組的診斷效能。Signaturea將AUC提升至0.958(95%CI:0.924～0.992，P<0.05)，診斷靈敏度和特異度均較高。Signatureb將AUC提升至0.964(95%CI:0.935～0.993，P<0.05)，診斷靈敏度高達(dá)96.67%，診斷特異度也較高。各指標(biāo)分析結(jié)果顯示Signaturea和Signatureb相比于單個microRNA的診斷效能有較大提升(圖3，表3)。

圖3 聯(lián)合多個microRNA區(qū)分兩組的ROC曲線 注：Signaturea：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p；Signatureb： has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR- 143-3p +has-miR-21-5p + has-miR-223-3p；AUC：曲線下面積

microRNAAUC95%CIP值△AUCP值截?cái)嘀奠`敏度/%95%CI特異度/%95%CIas-miR-26a-5p0.9150.862～0.968<0.00010.0430.04144<0.4378.3365.8～87.995.0086.1～99.0has-miR-191-5p0.9120.862～0.962<0.00010.0460.02289<1.6991.6781.6～97.275.0062.1～85.3has-miR-143-3p0.9100.860～0.960<0.00010.0480.00766<0.2383.3371.5～91.788.3377.4～95.2has-miR-21-5p0.7320.642～0.822<0.0001<0.5368.3355.0～79.771.6758.6～82.5has-miR-223-3p0.7170.618～0.815<0.0001<0.578.3365.8～87.971.6758.6～82.5Signaturea0.9580.924～0.992<0.0001<0.6286.6775.4～94.193.3383.8～98.2Signatureb0.9640.935～0.993<0.0001<0.3096.6788.5～99.683.3371.5～91.7

注：Signaturea：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p；Signatureb：has-miR-26a-5p + has-miR-191-5p + has-miR-143-3p + has-miR-21-5p + has-miR-223-3p；△AUC及其P值是基于has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p分別與Signaturea比較的結(jié)果

討 論

AD發(fā)病急、病情進(jìn)展快、病死率高、預(yù)后差, AD患者及時診斷和及時治療可以提升一年生存率超過50%[6]，因此AD患者早期診斷至關(guān)重要。診斷AD的傳統(tǒng)方法主要有經(jīng)食道超聲(transesophageal echocardiography, TEE)、主動脈CTA、MRI 及血管造影，但檢查耗時長、價格昂貴且需搬運(yùn)患者。如果患者體內(nèi)存在金屬植入物，傳統(tǒng)的方法也不能進(jìn)行診斷[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)一些可用于AD診斷的候選生物標(biāo)志物，如D-二聚體水平對AD診斷具有極高的靈敏度，但特異性較低(46.6%～68.6%)，誤診率高；平滑肌肌球蛋白重鏈(smMHC)和可溶性彈性蛋白片段(sELAF)靈敏度和特異性較高，但在臨床緊急情況下不可行，通過目前已有的生物標(biāo)志物想要實(shí)現(xiàn)AD快速準(zhǔn)確診斷較難。因此，臨床上急需找到具有高靈敏度和高特異度的生物標(biāo)志物以快速準(zhǔn)確地診斷AD。

近年來研究表明，血清microRNA在心血管發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。microRNA是一類非編碼微小分子RNA，長約20bp，功能主要為調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞生長、增殖、分化等生命過程，在不同生理或病理狀態(tài)下呈現(xiàn)差異性表達(dá)，并具有組織器官特異性[7]，有作為某些疾病診斷或預(yù)測標(biāo)志物的潛能。例如，Matsumoto等[8]發(fā)現(xiàn)血清miR-192，miR-194和miR-34a的水平能夠預(yù)測AMI后缺血性HF發(fā)生, Anke 等[9]也發(fā)現(xiàn)MiR423-5p 可作為HF診斷的生物標(biāo)志物。

AD 發(fā)病最重要的病理及生理機(jī)制為主動脈中層的彈力纖維、膠原蛋白變性，隨著內(nèi)膜破裂形成血腫，可撕開變性壞死的中層，導(dǎo)致夾層的形成并破裂。血流動力學(xué)改變使主動脈壁彈力纖維和膠原纖維變形，血管壁彈性下降，血管內(nèi)膜易被撕裂而形成動脈夾層，嚴(yán)重時可導(dǎo)致破裂出血。據(jù)先前的研究報道， miR-26a-5p可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的分化和凋亡，促進(jìn)增殖和遷移，促進(jìn)平滑肌由合成表型向收縮表型轉(zhuǎn)換增多[10]，miRNA-143-3p可調(diào)節(jié)平滑肌的表型轉(zhuǎn)化和血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[11]，所以miR-26a-5p和miRNA-143-3p表達(dá)降低可能促進(jìn)AD的形成；miR191-5p通過激活NF-κB信號通路有效地抑制血管生成[12]，miR-223-3p通過影響RPS6KB1 / HIF-1α信號通路來抑制血管生成[13]，所以miR-191-5p和miR-223-3p表達(dá)下降可能抑制夾層破裂后血管的修復(fù)過程；miRNA-21-5p調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞中的ERK-MAP激酶信號傳導(dǎo)途徑，對血管結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)整有重要作用，所以miRNA-21-5p表達(dá)下降可能影響血管結(jié)構(gòu)纖維化而導(dǎo)致夾層發(fā)生[14]。基于這些microRNA已知的生物學(xué)功能，我們猜測它們可能與AD的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)，但是具體這5個microRNA可能參與了AD發(fā)生發(fā)展的哪一環(huán)節(jié)有待探究，不能確定AD的是因還是果。所以我們探討了這5種microRNA在AD血清中的表達(dá)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)5種microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)在AD患者血清中表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。ROC曲線分析顯示5個microRNA診斷AD的AUC均在0.7以上，其中has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p和has-miR-143-3p診斷AD的AUC可達(dá)0.9以上，且靈敏度和特異度均較高。將多個microRNA聯(lián)合進(jìn)行ROC曲線分析，AUC>0.9的3個microRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p)聯(lián)合和全部5個microRNA聯(lián)合可分別將AUC提升至0.958和0.964，且靈敏度和特異性也得到較大的提升，說明將多個microRNA聯(lián)合診斷AD效果更好。我們的研究結(jié)果表明，血清microRNA有極大的潛能可以作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于AD的早期快速診斷。但是，本次研究也存在以下局限性：①本次研究樣本數(shù)量較少，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證以及更深入的分析來進(jìn)一步驗(yàn)證血清microRNA在AD診斷上的潛在價值；②血清microRNA檢測的費(fèi)用較高，檢測方法需要較先進(jìn)的技術(shù)，實(shí)際應(yīng)用有一定難度，距離運(yùn)用于臨床診斷仍有較長的路要走。③本研究并未比較AD與其他有相似癥狀的急診患者比如肺栓塞或急性心肌梗死患者中5種microRNA的表達(dá)差異，有待后續(xù)探究。

總之，我們的研究結(jié)果表明血清microRNA有作為AD早期快速診斷生物標(biāo)志物的應(yīng)用潛能，也為進(jìn)一步探索血清microRNA對于AD的早期診斷價值提供了數(shù)據(jù)理論支持。