超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽蛋氟喹諾酮類藥物殘留的不確定度分析

吾建祥，楊德毅，虞 冰，馬婧妤，李曉敏，刁銀軍

（1.浙江省金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 321017；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321017）

氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs） 是以喹諾酮母核結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，在其母核上進行結(jié)構(gòu)修飾，在喹諾酮結(jié)構(gòu)的6位上添加氟原子，在7位上引入哌嗪環(huán)或其他衍生物后構(gòu)成的新一代喹諾酮類藥物。氟喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣且作用強的特點，廣泛應(yīng)用于人和動物的疾病治療[1～3]。研究表明，F(xiàn)Qs可能會對人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)造成不良反應(yīng)，使用FQs抗生素會在動物的細(xì)胞或組織中殘留，同時，F(xiàn)Qs抗生素殘留物進入土壤后，可通過食物鏈傳播，引起人類不良反應(yīng)的發(fā)生，影響身體健康[4～6]。而且，動物性食品中較低濃度的FQs殘留容易引起耐藥性菌株的產(chǎn)生，致使該類藥物的有效使用劑量增加。FQs的殘留問題已引起各國的廣泛關(guān)注，我國以及CAC（國際食品法典委員會）、歐盟、美國、日本等國家或組織已將氟喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥藥物名單中，并制訂出相關(guān)的最高殘留限量（MRL）[7～9]，而且，我國已經(jīng)制定了有關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。

評定測量結(jié)果的不確定度可以保證檢測結(jié)果更加公正、準(zhǔn)確。同時，通過不確定度評定可以判定測量結(jié)果質(zhì)量的高低，因此，不確定度的評定也是實驗室質(zhì)量體系的重要部分[10]。依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》等[10～12]相關(guān)規(guī)定，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定禽蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的方法，對測定結(jié)果的不確定度進行評價及分析，旨為禽蛋品質(zhì)評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

禽蛋。購自金華市各大超市。

試劑。達氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度94.90%，北京振翔科技有限公司）、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.90%，北京振翔科技有限公司）、無水硫酸鈉和正己烷，為分析純；乙腈和甲酸，為色譜純。

儀器。LC-MS/MS8050超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津），BSA2202S電子天平（德國賽多利斯），BSA224S電子天平（德國賽多利斯），高速離心機（日本日立），渦旋振蕩器（德國IKA），氮吹儀（Organomation），調(diào)速多用振蕩器（金壇盛藍），臺式離心機（上海安亭）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 稱取樣品（已勻漿） 2.00 g于5 mL離心管中，加入無水硫酸鈉2 g。加入酸化乙腈（1%甲酸）溶液4 mL，渦旋混勻，超聲3 min，4℃條件下4 000 r/min離心5 min，將上層液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4 mL酸化乙腈重復(fù)提取1次，合并至離心管。提取液中加入乙腈飽和正己烷溶液10 mL，震蕩5 min，棄去上層溶液，重復(fù)凈化1次。氮氣吹干。準(zhǔn)確加入乙腈1 mL溶解，超聲，渦旋混勻；再加入水1 mL，超聲，渦旋混勻；然后，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管，4℃條件下10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Shim-pack GISS 2.1 mm×100 mm，1.9 μm，C18；流動相：A相為0.2%甲酸水溶液，B相為乙腈/甲醇（體積比6∶4）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為10%。

1.2.3 質(zhì)譜條件 分析儀器：LC-MS/MS-8050；源溫度：300℃；離子化模式：ESI（+）；DL溫度：250℃；加熱氣：空氣10.0 L/min；加熱模塊溫度：400℃；霧化氣：氮氣3.0 L/min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣：氮氣10.0 L/min；延遲時間：3 min；碰撞氣：氬氣。達氟沙星和恩諾沙星質(zhì)譜MRM方式檢測的部分參數(shù)不同（表1）。

表1 質(zhì)譜MRM方式檢測的部分參數(shù)Table 1 Some parameters detected by MRM

1.3 結(jié)果計算與表述

根據(jù)公式，計算氟喹諾酮類藥物的殘留量：

式中，X為樣品中待測組分的含量（μg/kg），C為測定液中待測組分的濃度（ng/mL），V為定容體積（mL），m為樣品稱樣量（g）。

1.4 不確定度分析

不確定度來源主要包括三大類：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線引入的不確定度，樣品測定引入的不確定度（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度（Urel(ss)）

稱取達氟沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容溶解，得到其1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。各吸1mL（1mg/mL） 至25 mL容量瓶中，得40μg/mL氟喹諾酮類混標(biāo)溶液；吸2.5mL上述溶液至10mL容量瓶，得10μg/mL氟喹諾酮混標(biāo)溶液；再吸上步溶液1 mL至10 mL容量瓶，得1μg/mL氟喹諾酮類混標(biāo)溶液；再吸上步溶液1 mL至10 mL容量瓶，得100 ng/mL氟喹諾酮類混標(biāo)溶液。

表2 不確定度的來源Table 2 Source of uncertainty

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度（Urel(sp)）根據(jù)均勻分布，達氟沙星和恩諾沙量標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對不確定度為：

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)品的純度。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的不確定度（Urel(sm)）根據(jù)JJG 1306－2008《電子天平檢定規(guī)程》，天平允許的最大誤差為±0.05 mg，準(zhǔn)確稱取達氟沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，按矩形分布，引入的相對不確定度均為：

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》10 mL容量瓶（A） 級容量允差為±0.02 mL，按矩形分布，引入相對不確定度為：

甲醇的體積膨脹系數(shù)為0.001 1，實驗室室溫在±3℃之間變動，按照均勻分布，溶液因溫度變化引入的相對不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對不確定度為：

2.2 標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線引入的不確定度（Urel(sr）)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制引入的不確定度（Urel(sc)）使用A級10mL吸量管分別準(zhǔn)確量取2、5、8和10mL，使用A級20mL吸量管量取20mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用A級50mL吸量管量取50mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；置于A級100mL單標(biāo)容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度線，依次得到溶液濃度為2、5、8、10、20和50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》A級100 mL單標(biāo)容量瓶容量允差為±0.02 mL，按矩形分布，引入的相對不確定度為：

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》A級10 mL吸量管容量允差為±0.02 mL，按矩形分布，引入的相對不確定度為：

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》A級20 mL移液管容量允差為±0.02 mL，按矩形分布，引入的相對不確定度為：

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》A級50 mL移液管容量允差為±0.02 mL，按矩形分布，引入的相對不確定度為：

甲醇的體積膨脹系數(shù)為0.001 1，實驗室室溫在±3℃之間變動，按照均勻分布，溶液因溫度變化引入的相對不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制引入的相對不確定度為：

2.2.2 擬合曲線引入的不確定度（Urel(mc)）取以上對應(yīng)質(zhì)量濃度為2、5、8、10、20和50 ng/mL的6種標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各1 μL分別測定，測定結(jié)果見表3。

式中，SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，p為試樣平行測量次數(shù)，n為擬合曲線的數(shù)據(jù)總數(shù)，C平為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度，C0為待測樣品溶液按回歸方程計算得到的濃度平均值。其中，SR的計算方法為：

其中，a為斜率，b為截距，n為測定次數(shù)，本試驗中6個質(zhì)量濃度依次測定，n=6；樣品平行測定次數(shù)p=3。

經(jīng)過計算，得到擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度為：Urel(mc達)=0.089 14；Urel(mc恩)=0.023 83。

標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線引入的相對不確定度為：

2.3 樣品測定引入的不確定度（Urel(ys)）

2.3.1 樣品溶液配制引入的不確定度（Urel(yr)）準(zhǔn)確稱取樣品（已勻漿）2.00 g，用乙腈溶解。

根據(jù)JJG 1306－2008《電子天平檢定規(guī)程》，天平允許的最大誤差為±0.05 mg，準(zhǔn)確稱取2種禽蛋樣品，按矩形分布，引入的相對不確定度為

表3 擬合曲線引入的不確定度Table 3 Uncertainty caused by fitting curve

乙腈的體積膨脹系數(shù)為0.001 37，實驗室室溫在±3℃之間變動，按照均勻分布，溶液因溫度變化引入的相對不確定度為：

樣品溶液配制引入的相對不確定度為：

2.3.2 儀器進樣引入的不確定度（Urel(yv)）樣品上機進樣量為1 μL，微量注射器體積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為±1%，符合對稱分布，則儀器進樣體積引入的相對不確定度為：

2.3.3 樣品測定重復(fù)性引入的不確定度（Urel(yc)）將重復(fù)測定的平均含量（C）、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDc）結(jié)果（表4） 分別代入公式和Urel(yc)=Uyc/C，得到樣品重復(fù)測量引入的相對不確定度為：Urel(yc達)=0.006 94，Urel(yc恩)=0.008 807。

表4 樣品測定重復(fù)性引入的不確定度Table 4 Uncertainty caused by repeatability of sample determination

2.3.4 樣品添加回收引入的不確定度（Urel(ya）)重復(fù)性試驗中達氟沙星、恩諾沙星的平均回收率（a）依次為86.67%、89.75%，將平均回收率（a）、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RS D）a結(jié)果（表5） 分別代入公式和Urel(ya)=Uya/a，計算得到回收率引入的相對不確定度為：Urel(ya達)=0.034 70，Urel(ya恩)=0.044 02。

樣品測定引入的不確定度為：

表5 雞蛋中氟喹諾酮類藥物后來的測定結(jié)果Table 5 The determination results of fluoroquinolones in eggs

2.4 相對合成不確定度的分析

計算公式為：

根據(jù)測定過程中各項不確度結(jié)果（表6），利用公式計算得到達氟沙星、恩諾沙星的相對合成不確度分別為0.100 5和0.051 25。

表6 合成不確定度的分析Table 6 Analysis on the synthetic uncertainty

2.5 擴展不確定度及結(jié)果表示

依據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》相關(guān)規(guī)定，置信區(qū)間為95%，包含因子k=2，LC-MS/MS法測定禽蛋氟喹諾酮類含量的擴展不確定度U=Urel×2×X（X指樣品含量平均值），由此得到LC-MS/MS法測定禽蛋氟喹諾酮類藥物含量的結(jié)果（表 7）。

表7 擴展不確定度的分析Table 7 Analysis on the expanded uncertainty

3 結(jié)論與討論

采用LC-MS/MS方法測定禽蛋氟喹諾酮類含量時產(chǎn)生不確定度的因素主要由三大部分組成，分別為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線、樣品測定（圖1）。其中，添加回收引入的不確定度對恩諾沙星的影響最大，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度對達氟沙星的影響最大。儀器進樣、樣品溶液配置、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配置對這2種物質(zhì)影響均不大。

圖1 禽蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的不確定度分析Fig.1 Uncertainty analysis of fluoroquinolones residues in poultry eggs