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    利用SSR標(biāo)記構(gòu)建枸杞品種分子身份證

    2018-10-26 02:12:28尹躍趙建華安巍李彥龍何軍曹有龍
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年9期
    關(guān)鍵詞:身份證枸杞等位基因

    尹躍 趙建華 安巍 李彥龍 何軍 曹有龍

    (寧夏農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心,銀川 750002)

    中國(guó)是世界上枸杞生產(chǎn)大國(guó),2012年枸杞栽培面積和產(chǎn)量分別為1.454×105hm2和2.049×105t,均居世界第一[1]。寧夏是世界枸杞發(fā)源地和正宗原產(chǎn)地,品種資源豐富,現(xiàn)已審定枸杞品種有20個(gè),收集保存種質(zhì)資源2 000份以上[2]。隨著枸杞品種選育和推廣速度加速,各地品種資源交流更加頻繁,造成同物異名和同名異物現(xiàn)象非常普遍。另外,枸杞品種選育主要采用群體選優(yōu)方式,使得核心骨干親本反復(fù)利用,如從“大麻葉”生產(chǎn)園中先后選育出“寧杞1號(hào)”、“寧杞2號(hào)”、“寧杞4號(hào)”和“精杞4號(hào)”等[3-6]品種,造成品種間遺傳差異變小,遺傳背景狹窄,為枸杞品種的準(zhǔn)確鑒定提出更高的要求。

    傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、同工酶等品種鑒定方法易受環(huán)境的影響,不僅需要具備扎實(shí)的專(zhuān)業(yè)理論知識(shí),而且耗時(shí)費(fèi)力。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)快速發(fā)展,SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已被國(guó)際植物品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)納入農(nóng)作物品種制定DUS(Distinctness,uniformity,stability)指南內(nèi)容,確定為植物新品種保護(hù)最廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記體系[7]。目前,利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了葡萄、梨、棉花、水稻及蘋(píng)果等[8-12]植物分子身份證。

    近年來(lái),基于高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了大量的枸杞SSR引物,篩選出了一批多態(tài)性好的引物。黨少飛等[13]對(duì)大麻葉枸杞進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(RAD-seq),分析了SSR基元分布特點(diǎn),其中三堿基重復(fù)單元最豐富,占重復(fù)序列總數(shù)的66.5%。王瑛等[14]通過(guò)對(duì)寧夏枸杞和黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了ESTSSR引物,從中篩選出10對(duì)EST-SSR引物可將7個(gè)枸杞品種逐一區(qū)分開(kāi)來(lái)。尹躍等[15]從11對(duì)SSR引物中篩選出4對(duì)引物可將12個(gè)枸杞品種完全區(qū)分開(kāi)來(lái),構(gòu)建了12個(gè)品種指紋圖譜。邵千順等[16]利用4對(duì)SSR引物構(gòu)建了17份枸杞種質(zhì)的DNA指紋圖譜。Chen等[17]基于枸杞果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,開(kāi)發(fā)了一批EST-SSR引物并對(duì)11份枸杞種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。上述研究主要是基于轉(zhuǎn)錄組和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記,這些標(biāo)記沒(méi)有定位到染色體和連鎖群上,在進(jìn)行枸杞品種鑒定及遺傳多樣性分析時(shí)所反映供試材料的信息不夠全面。然而,基于枸杞全基因組水平的SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

    本研究是基于枸杞全基因組測(cè)序結(jié)果(未公布)基礎(chǔ)上,從600對(duì)SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、均勻分布在枸杞12條染色體上的24對(duì)引物,以16個(gè)枸杞品種為試材,建立枸杞品種SSR分子身份證,以期枸杞品種鑒定及知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    所用的16個(gè)枸杞品種(表1),其中包括果用品種14個(gè)和菜用品種2個(gè),均采自寧夏農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃(38°38′49″N,106°9′10″E)。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè) 采用試劑盒法(天根,DP320)提取枸杞葉片基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,用BioPhotometer plus核酸蛋白儀(德國(guó),Eppendorf)測(cè)定DNA濃度和純度,并用滅菌的ddH2O將溶液稀釋至50 ng/μL,用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。

    1.2.2 引物來(lái)源、設(shè)計(jì)與合成 SSR引物來(lái)源于枸杞全基因組測(cè)序(數(shù)據(jù)未公布)序列所開(kāi)發(fā),利用Primer Premier5.0軟件隨機(jī)設(shè)計(jì)引物600對(duì),由ABI公司合成,并分別用FAM(藍(lán)色)和HEX(綠色)2種熒光集團(tuán)修飾上游引物5′端。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增體系15 μL,含 有 50 ng/μL DNA 模 板 1 μL、10×Buffer 1.5 μL、10 μmol/L dNTP 1.2 μL、5 μmol/L 上游引物 1 μL、5μmol/L 下游引物 0.2 μL、5 μmol/L M13熒光引物0.8 μL、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.1 μL 和 ddH2O 9.2 μL。PCR擴(kuò)增在GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer,USA)儀上進(jìn)行,擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,25 個(gè)循環(huán) ;94℃30 s,53℃ 30 s,72℃ 30 s,10個(gè)循環(huán);最后60℃30 min。

    在96孔板中每孔加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μL,PCR 產(chǎn)物 1.0 μL,95℃變性 3 min,用ABI3730進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)。

    1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用GeneMapper4.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,獲得不同樣品擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。利用SSR數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換軟件DataFormater 2.7[18]將擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)換為PowerMarker、Popgene和NTSYS輸入文件。利用PowerMarker V 3.25[19]軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Number of alleles,NA)、基因型數(shù)(Number of genotype,NG)和多態(tài)信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)。利用 Popgene 32 軟件[20]計(jì)算Shannon’s 信息指數(shù)(Shannon’s information index,I)。利用在線條形碼生成器(http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode128.php)構(gòu)建枸杞品種條形碼身份證。

    表1 供試16個(gè)品種及分子身份證編碼

    2 結(jié)果

    2.1 引物篩選

    通過(guò)600對(duì)引物對(duì)遺傳背景和表型性狀差異較大2個(gè)品種(寧杞1號(hào)和寧杞菜1號(hào))進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),最終確定多態(tài)性高且分別位于12條染色體上的24對(duì)SSR引物(表2)用于分子身份證的構(gòu)建。

    2.2 SSR引物擴(kuò)增多態(tài)性

    24對(duì)引物在16個(gè)枸杞品種中共檢測(cè)到等位基因155個(gè),每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因在3(LBSSR0480)-10(LBSSR0076 和 LBSSR0112),平均為6.5個(gè)(表3)。24對(duì)引物在16個(gè)枸杞品種中共檢測(cè)到基因型數(shù)208個(gè),每對(duì)引物檢測(cè)到基因型數(shù)在3(LBSSR0480)-14(LBSSR0112),平均為8.7個(gè)。多態(tài)信息含量(PIC)變幅在0.461(LBSSR01-18)-0.848(LBSSR0338),平均為 0.682。Shannon’s信息指數(shù)變幅在0.939(LBSSR0480)-2.055(LBSSR0112),平均為1.487。表明所篩選出的引物具有較高的多態(tài)性。

    2.3 最佳引物組合篩選與指紋圖譜

    基于最少引物鑒定最多種質(zhì)的原則。從24對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果中篩選出等位基因數(shù)、基因型數(shù)、PIC值均大于平均值,且Shannon’s信息指數(shù)>1.7引 物 共 有 6對(duì), 即 LBSSR0313、LBSSR0338、LBSSR0052、LBSSR0423、LBSSR0076 和LBSSR0112。引物兩兩組合,鑒定其對(duì)供試枸杞品種的區(qū)分率。引物組合LBSSR0052+LBSSR0423鑒定效率最高,可將16個(gè)品種全部區(qū)分開(kāi)來(lái),區(qū)分率均為100%,其次是引物組合LBSSR0052+LBSSR0112可以鑒定15個(gè)品種,區(qū)分率為93.8%(表4)。利用LBSSR0052和LBSSR0423這2對(duì)SSR引物構(gòu)建供試品種分子身份證。其中,寧杞1號(hào)在這2個(gè)SSR位點(diǎn)指紋圖譜見(jiàn)圖1。

    2.4 分子身份證編碼

    將供試品種全部區(qū)分開(kāi)的2對(duì)引物L(fēng)BSSR0052和LBSSR0423獲得的等位基因按照小到大的順序排列,并用阿拉伯?dāng)?shù)字01開(kāi)始賦值(表5)。例如,引物L(fēng)BSSR0052對(duì)16個(gè)品種擴(kuò)增共獲得8個(gè)等位基因,最小的為114 bp,賦值為01,依次類(lèi)推,最大的為191 bp賦值08,記為A的位點(diǎn)賦值為09。將每個(gè)品種在2個(gè)位點(diǎn)獲得的等位基因按照賦值數(shù)字編碼獲得每個(gè)品種獨(dú)有的字符串(表1)。

    再利用條形碼技術(shù)將每個(gè)品種的按照相同位點(diǎn)順序排列的編碼字符串轉(zhuǎn)化成每個(gè)品種獨(dú)特的條形碼標(biāo)識(shí)即分子身份證(圖2)。

    表2 24對(duì)SSR引物信息

    3 討論

    3.1 分子標(biāo)記的選擇

    隨著枸杞全基因組測(cè)序開(kāi)展,構(gòu)建高通量、準(zhǔn)確性高,易操作的覆蓋全基因組的枸杞種質(zhì)資源DNA分子身份證構(gòu)建將越來(lái)越收到重視。一種理想的DNA分子標(biāo)記具有重現(xiàn)性好、多態(tài)性高、易操作、共顯性且覆蓋整個(gè)基因組等特點(diǎn)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了3個(gè)發(fā)展階段:第一階段以雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記(RFLP);第二個(gè)階段以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記(RAPD、ISSR和SSR等);第三階段以單核苷酸為基礎(chǔ)的標(biāo)記(SNP)[21]。近年來(lái),分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用各種物種鑒定,國(guó)際植物品種保護(hù)聯(lián)盟在BMT測(cè)試指南草案中將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)記確定為SSR和SNP[22]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展,開(kāi)發(fā)了大量的SNP,但由于SNP高額費(fèi)用限制了應(yīng)用。相比較,SSR標(biāo)記成為了最廣泛應(yīng)用的標(biāo)記。本研究是基于枸杞全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)600對(duì)SSR引物,從中篩選24對(duì)多態(tài)性高的SSR引物,構(gòu)建了16個(gè)枸杞品種的分子身份證。

    3.2 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法的確定

    SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法主要有兩種:聚丙烯酰胺凝膠銀染技術(shù)和毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記技術(shù)。郝晨陽(yáng)等[23]對(duì)這兩項(xiàng)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)的比較,得出熒光標(biāo)記技術(shù)具有高通量、數(shù)據(jù)收集與處理效率高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、不同實(shí)驗(yàn)室易整合等優(yōu)點(diǎn)。邵千順等[16]利用15對(duì)引物對(duì)17份枸杞種質(zhì)擴(kuò)增,采用采用傳統(tǒng)的銀染技術(shù),15對(duì)引物的平均Shannon’s信息指數(shù)I為0.311,本研究24對(duì)熒光SSR引物在16個(gè)枸杞品種檢測(cè)到平均Shannon’s信息指數(shù)I為1.487,顯著高于前者。說(shuō)明本研究采用熒光SSR檢測(cè)效率高,數(shù)據(jù)更為精確可靠,為后續(xù)建立枸杞分子指紋數(shù)據(jù)庫(kù)更科學(xué)合理。

    表4 兩對(duì)引物組合對(duì)枸杞品種的區(qū)分

    圖1 寧杞1號(hào)在2個(gè)SSR位點(diǎn)的SSR指紋圖譜

    表5 等位基因賦值標(biāo)準(zhǔn)

    圖2 寧杞1號(hào)身份證條形碼

    3.3 分子身份證的編碼方法

    近年來(lái),基于SSR標(biāo)記構(gòu)建分子身份證的編碼方法在不斷地創(chuàng)新與發(fā)展,主要有3類(lèi)[9,11-12]:(1)篩選出可以區(qū)分所有種質(zhì)的引物組合,將這些引物擴(kuò)增到的帶型從小到大排序,依次編碼,按照固定引物順序,串聯(lián)帶型編碼,組成一串?dāng)?shù)據(jù),也就是品種分子身份證;(2)篩選出可區(qū)分所有種質(zhì)的核心引物,將核心引物所獲得等位基因從小到大排序,依次用數(shù)字編碼,組成特有字符串構(gòu)成分子身份證;(3)在第2種方法基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新,身份證由商品碼、指紋碼和補(bǔ)充碼3部分組成,構(gòu)建身份證信息更加全面,且能真實(shí)反映品種的信息。針對(duì)不同的物種及擴(kuò)增結(jié)果采用相對(duì)應(yīng)的編碼方法。本研究采用第2種方法,從24對(duì)引物中篩選出等位基因數(shù)、基因型數(shù)和PIC值大于平均值,且Shannon’s信息指數(shù)大于1.7,最終確定引物L(fēng)BSSR0052和LBSSR0423組合,可將供試品種全部區(qū)分開(kāi)。將這2對(duì)引物在所有品種擴(kuò)增獲得等位基因由小到大排序,用數(shù)字編碼賦值,構(gòu)建17個(gè)枸杞品種分子身份證,為后續(xù)構(gòu)建枸杞分子指紋數(shù)據(jù)庫(kù)提供合理的科學(xué)依據(jù)。

    4 結(jié)論

    這2對(duì)引物組合可區(qū)分全部供試品種。根據(jù)這2對(duì)引物對(duì)所有品種擴(kuò)增獲得等位基因按照由小到大排序,然后將每個(gè)品種在這兩個(gè)SSR位點(diǎn)的賦值依次組合,構(gòu)建16個(gè)枸杞品種的分子身份證。結(jié)果表明SSR標(biāo)記技術(shù)可以作為枸杞品種鑒定和分子身份證構(gòu)建的有效技術(shù)手段。

    本研究是基于枸杞全基因組測(cè)序結(jié)果(未公布)基礎(chǔ)上,從600對(duì)SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、均勻分布在枸杞12條染色體上的24對(duì)引物,并對(duì)16個(gè)枸杞品種進(jìn)行SSR擴(kuò)增分析,共檢測(cè)到155個(gè)等位基因,平均為6.5個(gè)和208個(gè)基因型,平均為8.7個(gè)。平均多態(tài)信息含量(PIC)和Shannon’s信息指數(shù)分別為0.682和1.487?;谧钌僖镨b定最多種質(zhì)的原則,需要同時(shí)滿足2個(gè)條件:(1)檢測(cè)到等位基因數(shù)、基因型數(shù)和PIC值均大于平均值,(2)Shannon’s信息指數(shù)>1.7。最終確定引物L(fēng)BSSR0052和LBSSR0423符合要求,而且

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