檸條錦雞兒CkP5CS基因克隆及表達特性分析

張騰國 史中飛 寇明剛 鄭晟 王娟

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

非生物脅迫如鹽、干旱、冷等都能影響植物生長發(fā)育。為了保護自身免受不利條件的傷害，植物已經發(fā)展出許多生理、細胞和分子機制［1］。研究得最深入的保護機制之一為脯氨酸代謝。植物中的應激反應通常伴隨著脯氨酸在不同組織中的積累［2］。累積的脯氨酸可以作為細胞內滲透劑［3］、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除劑［4］、細胞結構維持者［5］和信號轉導分子，引發(fā)多種應激反應途徑［6］。在植物體中，已知有兩條途徑合成脯氨酸，一條為谷氨酸途徑，另一條為鳥氨酸途徑［7-8］，而谷氨酸衍生的途徑是植物在脅迫條件下合成脯氨酸的主要途徑［9］。在谷氨酸衍生途徑中，谷氨酸被Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）還原為 γ-谷氨酸半醛（GSA），然后GSA環(huán)化自身形成P5C［10］。在這一途徑中，P5CS是關鍵酶，同時它也是一個雙功能酶，在其N端與谷氨酰激酶（γ-GK）同源，C端與谷氨酸-γ-半醛脫氫酶（GSA）同源，這使得P5CS同時具有這兩種酶的活性。P5CS可直接催化谷氨酸生成GSA，且經研究表明，在滲透脅迫下，植物體內的脯氨酸積累水平主要受P5CS的影響，該酶是植物合成脯氨酸的關鍵酶，其活性受到脯氨酸的反饋調節(jié)［11］。

目前已經從擬南芥［12］、蒺藜苜蓿［13］、紫花苜蓿［14］、番茄［15］、菜豆［16］、高粱［17］及番木瓜［18］等不同植物中克隆出了P5CS基因。研究表明，擬南芥P5CS基因受到干旱、鹽堿和ABA等脅迫的誘導［11］。油菜中P5CS1和P5CS2受到 ABA、NaCl、PEG的誘導［19］。干旱脅迫條件下轉VaP5CS基因的轉基因煙草脯氨酸及生物量的積累明顯高于非轉基因煙草［20］。同樣，馬鈴薯、水稻、小麥中過量表達P5CS明顯增強轉基因植株的脯氨酸含量以及脅迫耐受能力［21-23］。因此，P5CS基因在調控植物體內脯氨酸的合成、提高植物抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮重要的作用。

檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）是豆科錦雞兒屬旱生植物，在中國分布于內蒙古西部、陜西北部及寧夏等地區(qū)。檸條錦雞兒抗逆性強，能耐低溫及酷熱，具有防風固沙、保土蓄水、改良和維持生態(tài)環(huán)境及調節(jié)小氣候等作用，是荒漠、荒漠草原地帶植樹造林和防風固沙的先鋒樹種。目前，檸條錦雞兒P5CS基因的克隆與功能研究還未見報道。本研究從檸條錦雞兒中分離脯氨酸合成關鍵酶基因P5CS的全長cDNA序列，分析該基因的序列特征、進化關系和不同脅迫誘導下的表達模式，旨在為利用該基因改良荒漠植物的抗逆境脅迫能力和指導荒漠地區(qū)植被建設提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

挑選籽粒飽滿、大小均勻的檸條錦雞兒種子分別播種到MS培養(yǎng)基中，在溫度為25℃，光照強度130 μmol·m-2·s-1，光照時間為 16 h 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，待檸條錦雞兒植株長至10 cm左右，轉入不同條件進行不同種類的非生物脅迫。

1.1.1 鹽脅迫 用Hoagland營養(yǎng)液配制的不同濃度的NaCl溶液（0 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15mol/L和0.2 mol/L）浸泡同批生長的檸條錦雞兒植株，48 h后分別剪取不同處理的檸條錦雞兒葉片，提取RNA并測定脯氨酸的含量。

1.1.2 低溫脅迫 將同批生長的檸條錦雞兒植株苗置于4℃環(huán)境進行不同時間段（0 h、12 h、24 h、36h和48 h）處理，分別剪取不同處理的檸條錦雞兒葉片用于RNA的提取。

1.1.3 PEG滲透脅迫 用Hoagland營養(yǎng)液配制不同質量分數(shù)的PEG-6000溶液（0%、5%、10%、15%和20%）來模擬不同的干旱程度，處理48 h后剪取不同處理的檸條錦雞兒葉片，提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 檸條錦雞兒P5CS基因的克隆P5CS基因中間片段克隆，利用Trizol試劑進行檸條錦雞兒葉片總RNA的提取，以提取的RNA為模板，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒進行合成第一鏈cDNA。通過GenBank查找下載已經克隆得到的植物P5CS基因序列，進行序列對比，根據(jù)比對的結果，在相對保守的區(qū)域設計了5對簡并引物CkP5CSU1、CkP5CSD1；CkP5CSU2、CkP5CSD2；CkP5CSU3、CkP5CSD3；CkP5CSU4、CkP5CSD4；CkP5CSU5、CkP5CSD5（表1），每對引物預期擴增序列有部分重疊。以檸條錦雞兒反轉錄所得到的cDNA為模板，按照Premix Ex Taq DNA Polymerase的反應要求說明用25 μL反應體系進行PCR擴增，反應體系：模板：1 μL，上下游引物：各1 μL，Premix Ex Taq酶：12.5 μL，ddH2O ：9.5 μL，總體積 ：25 μL。擴增結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳電泳，依據(jù)離心柱型EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收試劑盒方法回收，回收產物連接pTG19-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，隨機挑取若干白斑菌落進行PCR及酶切鑒定，將鑒定合適的陽性克隆送華大基因公司測序。

RACE方法克隆P5CS基因全長，以提取到的檸條錦雞兒總RNA為模板，按照3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa公司）的操作說明進行3′-RACE擴增反應，根據(jù)已得到的檸條錦雞兒P5CS的序列片段設計基因特異性引物3′RU1和3′RU2（表1），總RNA的反轉錄依據(jù)試劑盒說明進行操作，以反轉錄得到的cDNA為模板，用引物3′RU1和試劑盒中自帶的引物3′RACEO（TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT）進行一擴PCR，以一擴PCR產物為模板，用引物3′RU2和試劑盒自帶引物 3′RACEI（CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG）進行二擴PCR。擴增產物用普通瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，連接入pTG19-T載體，轉化大腸桿菌，鑒定為陽性的克隆進行測序。按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0的操作說明進行5′-RACE的擴增，根據(jù)克隆的檸條錦雞兒P5CS基因中間片段序列設計基因特異性上游引物 5′RD1 和 5′RD2（表 1）。按照試劑盒操作說明將總RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，用引物5′RD1和試劑盒自帶上游引物AAP（GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG）進行一擴PCR，以一擴PCR產物為模板，用引物5′RD2和試劑盒自帶上游引物AUAP進行二擴PCR。將產物純化后與pTG19-T載體連接，熱激法轉化大腸桿菌Trans5α后篩選陽性克隆進行測序。

1.2.2 檸條錦雞兒P5CS預測蛋白質的生物信息學分析 用DNAStar軟件Megalign模塊中的ClustalW方法進行氨基酸序列比對及保守序列分析；應用蛋白在線分析工具TopPred（http://mobyle.pasteur.fr/cgibin/port-al.py？#forms：：toppred）對預測蛋白進行疏水性和拓撲結構分析；利用SOPMA（http://www.expasy.org/resources）在線軟件對預測蛋白的二級結構進行預測；應用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）對預測蛋白的三級結構進行分析。

1.2.3 檸條錦雞兒P5CS基因的組織特異性表達檢測 剪取長勢一致的檸條錦雞兒根、莖、葉不同組織部位，根據(jù)實時熒光定量PCR的方法，檢測檸條P5CS基因在不同組織中的表達量。

1.2.4 逆境對檸條錦雞兒P5CS基因的轉錄水平影響 采用實時熒光定量PCR，選取長勢一致的檸條經不同逆境處理后對P5CS基因表達進行分析，從不同逆境處理后檸條葉片中提取RNA，以反轉錄得到的 cDNA 為模板，分別以 ActinF（AF）、ActinR（AR）為管家基因引物，以P5CSDL-U、P5CSDL-D為檸條P5CS基因的引物，依據(jù)寶生物工程公司的SYBR Premix Ex TaqTM說明操作進行PCR擴增，每個樣品做3個重復。擴增程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)；55-95℃每30s漸進升高0.5℃，81個循環(huán)。利用2-△△Ct方法進行數(shù)據(jù)分析，確定CkP5CS基因的相對表達量。

1.2.5 游離脯氨酸含量的測定 依據(jù)酸性茚三酮染色法測定脅迫處理后脯氨酸的含量。稱取鹽脅迫處理的檸條葉片各0.5 g，加入2 mL 3%的磺基水楊酸充分研磨，沸水浴10 min，15 000 r/min，離心15min，后取上清液0.25 mL，加入3 %的磺基水楊酸0.75 mL，1 mL冰醋酸和2 mL 2.5%的茚三酮，95℃水浴1 h，然后用4 mL甲苯萃取2 h，以甲苯溶液為空白對照，測OD520。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 測得的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進行分析，用Origin 9.0進行做圖。

2 結果

2.1 檸條錦雞兒P5CS基因的克隆與序列分析

將GenBank網(wǎng)站公布的已經克隆得到的植物P5CS基因CDS區(qū)序列下載后，用DNAstar軟件MegAlign分析模塊進行序列同源性對比，根據(jù)比對結果，設計了5對兼并性引物。以檸條葉片組織中提取出來的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，擴增得到了5條大小分別為為663、544、507、417和363 bp的條帶，測序后用序列拼接軟件進行拼接得到一條長度為1 962 bp的序列片段，與其它植物的P5CS基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，與大豆GmP5CS的同源性較高，表明該擴增產物是檸條P5CS基因片段。3′RACE 用 TaKaRa公司的 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒擴增得到了757 bp左右大小的片段，經序列比對發(fā)現(xiàn)該序列5′端序列與前面擴增得到檸條P5CS基因中間片段的3′端序列完全相重疊，說明3′RACE擴增得到的片段與之前克隆得到的部分片段為同一條基因。5′RACE按照Invitrogen公司5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0試劑盒擴增得到了一個305 bp大小的片段。測序結果經序列比對發(fā)現(xiàn)該片段3′與前面擴增得到的檸條P5CS基因中間片段的5′端序列完全重疊，說明5′RACE擴增得到的片段與之前克隆得到的中間片段為同一條基因的。

表1 PCR引物序列

利用軟件將擴增的中間片段和RACE擴增的5′端序列和3′端序列進行拼接，得到一條全長為2 604 bp的基因序列（圖1），包含一個2 139 bp的開放閱讀框（ORF），編碼的蛋白質含712個氨基酸，分子量為76.8 kD，等電點為8.6。起始密碼子ATG前5′非翻譯區(qū)（5′UTR）長102 bp，終止密碼子TAA后面有一段363 bp的3′非翻譯區(qū)（3′UTR），包含11 bp polyA。為了進一步確定以上P5CS基因部分擴增片段，以及5′RACE和3′RACE擴增片段屬于同一基因，依據(jù)3′RACE和5′RACE擴增得到的序列設計上下游引物進行擴增，得到的片段經序列比對，與拼接序列的堿基完全一致。

將GenBank中公布的已經克隆得到的植物P5CS序列，用DNAStar軟件中Megalign模塊的ClustalW法進行氨基酸序列的比對。結果（圖2）表明，CkP5CS蛋白與許多植物的P5CS蛋白具有較高的相似度，其中與大豆GmP5CS（XM_006573245）、蒺藜苜蓿MtP5CS（XM_013599503）、白刺花SdP5CS（JX307643）、豇豆VuP5CS（AB056452）的相似度分別為84.2%、82.3%、85.1%和82.6%。

檸條錦雞兒CkP5CS基因推測的氨基酸序列的保守區(qū)域與大豆GmP5CS、蒺藜苜蓿MtP5CS、白刺花SdP5CS、豇豆VuP5CS基因推測的氨基酸序列的保守結構域一致，含有以下5個主要功能域：ATP結合位點、谷氨酸激酶結構域、谷氨酸-γ-半醛脫氫酶（GSADH）結構域、一個假想的亮氨酸結構域及NAD（P）H結構域（圖2）。CkP5CS基因編碼產物的這些特征表明，該基因所控制編碼的氨基酸是典型的植物二氫吡咯-5-羧酸合成酶，CkP5CS可能在檸條錦雞兒脯氨酸合成途徑中起作用。

應用蛋白在線分析工具TopPred對CkP5CS預測蛋白進行疏水性和拓撲結構分析，結果顯示該預測蛋白為親水蛋白結構，有6個不確定的跨膜結構域（圖3-A）；利用SOPMA在線軟件對CkP5CS預測蛋白的二級結構進行預測，結果（圖3-C）顯示，檸條CkP5CS預測蛋白包含38.34%的α-螺旋（Alpha helix）、25.7% 的延伸鏈（Extended strand）、9.41% 的 β-轉角（Beta turn）和26.54%的無規(guī)則卷曲（Random coil）。應用SWISS-MODEL對CkP5CS蛋白的三級結構進行預測，SWISS-MODEL只預測了同源性部分（氨基酸殘基范圍：291-711）的模型，已經預測出的三級結構模型（圖3-B）顯示，該蛋白為P5CS。

圖1 檸條錦雞兒CkP5CS全長序列及預測氨基酸序列

2.2 檸條錦雞兒CkP5CS基因組織特異性表達檢測

從長勢一致的檸條錦雞兒植株根、莖、葉中提取RNA，進行實時熒光定量PCR分析，結果（圖4）表明，CkP5CS基因在其根、莖、葉中均有表達，其中葉中的表達量最高；其次是根，在莖中的表達量最低。

2.3 逆境脅迫下CkP5CS基因轉錄水平實時熒光定量PCR結果分析

低溫脅迫下實時熒光定量PCR實驗結果（圖5）表明，檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達量受低溫脅迫（4℃）誘導。在4℃處理12 h、24 h、36 h及48 h后，CkP5CS基因的轉錄水平較對照組分別提高了1.753、3.032、2.297及2.621倍，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在低溫脅迫時間達到24 h時，CkP5CS基因的轉錄水平達到最大值，隨著脅迫時間的延長，CkP5CS基因的轉錄水平有所下降，但仍然高于對照組，說明在較長時間的低溫冷脅迫下，CkP5CS基因的表達能力有所下降，但是對于低溫脅迫依舊有所響應。

鹽脅迫下實時熒光定量PCR實驗結果（圖6）表明，檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達量受鹽脅迫的誘導。在濃度為0.05、0.1、0.15及0.2 mol/L的NaCl溶液處理后，CkP5CS基因的轉錄水平較對照組分別提高了1.221、3.042、1.121及0.526倍，呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降的趨勢。在0.1 mol/LNaCl脅迫下，CkP5CS基因的轉錄水平達到最大值，隨著鹽脅迫濃度的升高，CkP5CS基因的轉錄水平逐漸降低，在0.2 mol/LNaCl脅迫時，其表達量僅為對照組的0.526，結果表明CkP5CS基因表達受到低濃度鹽脅迫的誘導，高濃度的鹽脅迫抑制其表達。

圖2 CkP5CS與其它植物P5CS氨基酸序列比對

PEG滲透脅迫下實時熒光定量PCR實驗結果（圖7）表明，檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達量受PEG滲透脅迫的誘導。在濃度為5%、10%、15%、20%的PEG6000溶液處理后，CkP5CS基因的轉錄水平較對照組分別上升了1.319、2.346、3.473和4.889倍，隨著PEG6000濃度的增加，CkP5CS基因的轉錄水平也在隨之上升，在20%的PEG6000溶液處理下，CkP5CS基因的轉錄水平達到最大。說明CkP5CS基因的表達對PEG滲透脅迫的誘導較為敏感，且滲透脅迫程度越大其表達越明顯。

圖3 CkP5CS蛋白結構分析

圖4 CkP5CS基因組織特異性表達分析

圖5 低溫脅迫下CkP5CS基因的表達量

2.4 鹽脅迫下檸條錦雞兒中脯氨酸含量的變化

脯氨酸的含量受鹽脅迫的誘導，在0.05、0.1、0.15和0.2 mol/L的NaCl處理下，檸條錦雞兒中脯氨酸的含量與對照組相比分別提高了73.77%、78.69%、349.58%、414.56%，差異達到顯著水平（*P＜0.05）（圖8）。表明鹽脅迫條件下通過脯氨酸的積累穩(wěn)定細胞自身結構，降低活性氧積累帶來的損傷。

圖6 鹽脅迫下CkP5CS基因的表達量

圖7 PEG滲透脅迫下CkP5CS基因的表達量

圖8 鹽脅迫過程中檸條錦雞兒脯氨酸含量的變化

3 討論

植物在遭遇逆境脅迫時，通過主動積累小分子滲透物質來維持細胞內滲透壓的平衡。脯氨酸是典型的小分子滲透物質，它能夠穩(wěn)定細胞的膜結構，增加細胞原生質層的濃度防止細胞失水，平衡細胞的滲透壓使細胞能夠進行正常的生理生化反應。在植物受到滲透脅迫時，植物體內的脯氨酸含量會大幅度的增加。因此，脯氨酸的積累有利于細胞自身結構的穩(wěn)定，而且能夠降低活性氧積累帶來的損傷。而P5CS則是植物體內催化谷氨酸途徑合成脯氨酸過程中的限速酶，在脯氨酸的合成過程中起著至關重要的作用。本研究中利用RT-PCR結合RACE技術從檸條錦雞兒中克隆得到了CkP5CS基因，該基因預測蛋白質序列與已知的其它植物該基因的預測蛋白質序列有很高的相似性，說明CkP5CS基因在物種進化上具有很高的保守性。CkP5CS具有高等植物中P5CS蛋白質具有的5個保守結構域：NADPH結合位點、ATP結合位點、谷氨酰激酶（GK）結構域、亮氨酸結構域、谷氨酸半醛（GSA）結構域，預測出的三級結構模型顯示，該蛋白符合Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶三維結構。

實時熒光定量PCR的結果表明，CkP5CS基因在檸條錦雞兒的根、莖、葉中均表達。此外，CkP5CS基因受低溫和PEG滲透脅迫誘導表達，與甜高粱［24］、番木瓜［18］和擬南芥［11］P5CS基因的表達模式相同。說明同一類植物的P5CS基因能夠響應不同的逆境脅迫，而不同植物的P5CS基因也能受到同一種脅迫的誘導表達。

檸條錦雞兒CkP5CS基因的表達受鹽脅迫的誘導，隨著鹽脅迫濃度的升高，CkP5CS基因的表達呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降的趨勢。而檸條錦雞兒植株中脯氨酸的含量同樣受到鹽脅迫的誘導，隨著鹽脅迫濃度的升高，脯氨酸的含量呈上升趨勢。但CkP5CS基因的表達的變化與脯氨酸的含量的變化趨勢不一致，0.15 mol/L、0.2 mol/L鹽處理下脯氨酸的含量增加而CkP5CS基因的表達量下降。Hong等［25］研究表明P5CS基因在植物中催化脯氨酸的生物合成反應中，Pro合成不僅受到P5CS的轉錄激活的調節(jié)，還受到該途徑終產物的反饋調節(jié)。Silva-Ortega等［26］的研究結果也表明，在鹽脅迫條件下，仙人掌P5CS酶活性的變化與P5CS基因轉錄水平的變化以及脯氨酸含量的變化不成正相關。說明P5CS酶活性不僅受到轉錄水平的調控，可能還受到轉錄后水平及蛋白質水平的反饋調控。

4 結論

檸條錦雞兒CkP5CS基因全長2 604 bp，包括5′-UTR 102 bp，3′-UTR 363 bp，開放閱讀框 2 139 bp，能編碼712個氨基酸，預測蛋白質分子量為76.8 kD，理論等電點為8.6，二級結構主要包括α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。CkP5CS基因的表達沒有組織特異性，其表達受低溫、高鹽和PEG滲透脅迫的誘導，在檸條錦雞兒適應低溫、高鹽和滲透脅迫過程中發(fā)揮作用。