雙重實時熒光PCR定量檢測動物產(chǎn)品中牛源性成分

高志強 汪琳 蒲靜 尹羿 張偉 趙相鵬 姚震宇

（北京出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，北京 100026）

近些年來，動物產(chǎn)品質(zhì)量和安全成為公眾關(guān)注問題，其中動物產(chǎn)品摻假是一個嚴重的問題，一些商家為賺取利潤，常使用便宜劣質(zhì)的馬肉、豬肉、鴨肉、雞肉甚至鼠肉來代替高品質(zhì)牛羊肉，如歐洲出現(xiàn)的馬肉丑聞和一些以禽肉代替牛羊肉的摻假案例。由于摻假肉品可能含有導致發(fā)生過敏反應的動物源性成分，而且某些肉品對于特定的宗教被視為禁忌，因此動物產(chǎn)品摻假問題已經(jīng)給人民健康、文化和宗教信仰帶來很大風險。

不同動物源產(chǎn)品的外觀本身具有一定相似性，而且經(jīng)過一定的工藝處理，難以從肉眼上進行鑒定。目前動物源性成分鑒定主要采取分子生物學方法進行，檢測方法包括核酸探針法，PCR及實時熒光PCR法。由于線粒體DNA（mt DNA）種屬特異性較強，可以對動物進行種屬鑒定，目前多數(shù)核酸檢測方法針對mt DNA，這些mt DNA包括細胞色素b（Cyt b），18S核糖體DNA，12S rDNA以及細胞色素C氧化酶亞單位I基因等［1-3］，目前發(fā)布的動物源性成分檢測的國家標準均針對線粒體DNA［4］。但目前也建立了一些針對動物基因組相對保守且能進行種屬鑒定的區(qū)域進行檢測的方法，這些基因包括衛(wèi)星DNA，生長激素基因，白細胞介素2前體基因等［5-7］。在定量檢測動物物種成分時，還需選擇一個基因拷貝數(shù)相對固定的內(nèi)參基因，便于比例計算和校正誤差，一般選擇在哺乳動物和禽類間保守的序列，這些序列包括線粒體DNA，生長激素基因，beta肌動蛋白以及肌肉生長抑制素基因等［2-3］。

由于基于核酸擴增的檢測方法靈敏度都很高，而不同種動物產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工和處置過程中，難免出現(xiàn)肉品間相互交叉污染，因此不能單純依據(jù)定性基因檢測結(jié)果作出摻假的判斷結(jié)論。歐盟發(fā)布的2013/99/EU規(guī)則，規(guī)定如果特定肉產(chǎn)品中含有＞1%的其它肉品成分認為是摻假。因此為避免上述假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，在檢測一些動物產(chǎn)品時，有必要對動物源性成分進行定量［8］。采用熒光PCR對線粒體和核內(nèi)染色體DNA和線粒體DNA進行定量檢測的方法均有報道［1-7］。但未見在對樣品和標準品充分前處理的基礎(chǔ)上進行動物源性成分定量檢測的報道。

考慮到不同樣品可能含水量不同，直接提取DNA檢測可能造成較大誤差，因此本研究中，以牛肉作為檢測目標，通過將檢測樣品凍干、粉碎，并制備一系列具有不同含量被檢目標成分的標準品肉粉，同時分別提取DNA，應用建立的哺乳動物和禽通用型、牛源性成分實時定量熒光PCR檢測方法，對動物產(chǎn)品中牛源性成分進行檢測，以期實現(xiàn)對肉品中牛源成分的精準檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 常見肉類包括雞肉、牛肉、馬肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉、狗肉、魚肉及兔肉，本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（DP304），購自天根生化科技有限公司；Ex HSTaqDNA聚合酶、dNTP等購自TaKaRa公司。核酸純化柱及套管，購自上海生工。

1.1.3 主要設(shè)備 LightCycler 480，Roche公司；微量核酸濃度測定儀Nano quant，TECAN公司；凍干機，SIM公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的合成 合成以下3套引物探針，其中牛源引物探針針對衛(wèi)星IV DNA［1］，哺乳動物和禽通用型引物探針針對肌肉生長抑制素基因（內(nèi)對照）［2］，引物探針名稱、序列及靶基因見表1。

表1 引物、探針的名稱、序列及靶基因

1.2.2 定量標準品制備、樣品前處理和DNA提取 將各種動物肉類去除脂肪、筋膜后與收集樣品于凍干機中冷凍干燥24 h以上，于粉碎機中充分粉碎后制成粉末。以雞肉為摻入基質(zhì)，配制含100%、50%、25%、10%、1%及0.1%牛源成分的凍干肉粉作為定量標準品，同時分別配制含15%，8%和1%的牛源成分的凍干肉粉進行定量方法驗證測試。精確稱量上述標準品和樣品凍干粉25 mg于1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明書提取凍干粉基因組DNA，洗脫DNA于100 μL無核酸酶的純化水中，保存于-80℃。

1.2.3 DNA濃度測定與稀釋 測定前，取2 μLDNA溶液使用Nano quant分別測定260 nm及280 nm之吸光度值（OD）。計算DNA濃度和純度，其比值應介于1.7-2.0之間，根據(jù)測定結(jié)果將各個DNA樣品稀釋至 20 ng/μL。

1.2.4 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化 于ROCHE480設(shè)備進行反應體系優(yōu)化，對反應參數(shù)，各種成分的濃度進行優(yōu)化，建立檢測牛源以及通用型雙重反應體系，其中通用型檢測通道作為內(nèi)對照。體系優(yōu)化后，使用4%的瓊脂糖凝膠對陽性（牛肉DNA為模板）和陰性（植物DNA為模板）PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，觀察特異性反應條帶。

1.2.5 靈敏度試驗 應用建立的雙重反應體系對含100%、50%、25%、10%、1%及0.1%牛源成分的凍干肉粉進行檢測，以驗證方法的靈敏度。

1.2.6 特異性試驗 應用建立的雙重反應體系對常見肉類包括雞肉、牛肉、馬肉、綿羊肉、山羊肉、豬肉、狗肉、魚肉及兔肉進行檢測，以驗證方法的特異性。

1.2.7 重復性試驗 通過對25%、10%和1%共3個含不同濃度牛源成分凍干粉進行3次重復檢測，通過計算△Ct標準差（SD）和相對標準差（RSD）來確定方法的可重復性。

1.2.8 熒光定量PCR方法的定量檢測標準曲線建立和應用 為評估定量方法的實用性和特異性以及方法的實用性，應用定量標準品和自制的3份牛源成分含量分別為15%、8%和1%（編號為B15，B8和B1）的模擬樣品及6份送檢牛肉樣品（S1-S6）提取的DNA進行上機檢測，每個DNA樣品上樣5 μL（即DNA總量100 ng），同時設(shè)水對照和陰性對照，每個標準品和檢測樣品核酸設(shè)3個重復。求取各組Ct值的平均值，將各濃度標準品的檢測Ct值平均值減去內(nèi)部對照基因Ct值平均值后所得之數(shù)值△Ct為縱軸，以含不同濃度牛源成分標準品濃度的對數(shù)值為橫軸，進行線性回歸分析并制作標準曲線，計算回歸系數(shù)（R2）和PCR擴增效率［9］。然后利用標準曲線對各個樣品進行定量，通過計算樣品的標準差和相對標準差來評價檢測結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化確立反應體系：每個反應體系均包含1×Ex HS PCR Buffer，200 nmol/L dNTP，0.5 μmol/L的牛源上下游引物，0.4 μmol/L的通用型上下游引物，0.25 μmol/L的牛源檢測探針以及0.2 μmol/L的通用檢測探針。

反應參數(shù)為 95℃ /3 min；94℃/15 s，60℃ /35 s，35個循環(huán)，每個循環(huán)60℃時分別收集FAM和VIC通道熒光信號。對（牛肉DNA為模板）和陰性（植物DNA為模板）PCR產(chǎn)物進行電泳，陽性PCR產(chǎn)物可以觀察到大小分別約為87 bp和76 bp的特異性條帶，見圖1。

圖1 雙重熒光PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 靈敏度試驗結(jié)果

應用建立的雙重反應體系可以檢出牛源成分含量為0.1%的凍干肉粉（圖2），表明方法的靈敏度可以滿足要求。

圖2 雙重熒光PCR方法檢測牛源成分的靈敏度試驗結(jié)果

2.3 特異性試驗結(jié)果

應用檢測牛源性成分以及通用型反應體系對常見肉類進行檢測，結(jié)果顯示建立的雙重檢測方法與其他肉類無交叉反應。

2.4 重復性試驗結(jié)果

重復性試驗結(jié)果見表2，相對標準偏差小于5%，表明方法的重復性可以滿足要求。

表2 方法對含不同濃度牛源成分凍干粉檢測的重復性

2.5 熒光定量PCR方法的定量檢測標準曲線建立

對制備的含牛源成分的凍干肉粉定量標準品檢測結(jié)果見圖3。檢測結(jié)果經(jīng)計算后進行線性回歸，相關(guān)數(shù)據(jù)及獲得的方程圖形見圖4和表3。回歸的相關(guān)系數(shù)R2為0.966，PCR反應效率（E）=（10-1/k-1）×100%=93.6%，表明建立的方法擴增效率較高。

圖3 含100%、50%、25%、10%及1%牛源成分的凍干肉粉定量標準品檢測結(jié)果

2.6 對模擬和送檢樣品的檢測應用

3份含不同牛源成分的自制模擬樣品和6份送檢牛肉樣品的檢測結(jié)果見表4，本方法檢測的結(jié)果與自制模擬樣品的已知值非常吻合，而且對于送檢的6份牛肉樣品，計算牛肉含量為99.55%-100.18%。所有檢測結(jié)果的RSD均小于5%。

圖4 標準品線性回歸方程圖形

表3 定量標準品檢測相關(guān)數(shù)據(jù)

表4 模擬和送檢樣品檢測結(jié)果

3 討論

由于基因擴增的檢測方法靈敏度都很高，因此定性檢測結(jié)果不能排除不同種動物產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲存及運輸過程中的微量污染問題。因此本研究以牛肉產(chǎn)品為目標，參考相關(guān)文獻，選取牛衛(wèi)星IV DNA和哺乳動物和禽保守的肌肉生長抑制素基因（內(nèi)對照）作為檢測目標［1-2］，建立了雙重熒光定量PCR檢測方法，實現(xiàn)了動物產(chǎn)品中牛源成分的定量檢測。經(jīng)對自制模擬樣品和送檢牛肉樣品進行檢測，取得滿意結(jié)果。由于不同來源動物制品制作過程和儲運條件的不同，因此含水量不同，為提高定量方法的準確性并盡量減少誤差，本研究采用了在前處理過程中先將樣品進行冷凍干燥并充分粉碎，同時制備出含有不同牛肉成分的標準凍干粉，使用分析天平準確取樣來消除樣品間的差異。此外，在進行DNA提取時，不同來源樣品提出的DNA的量也可能存在差異，因此需要在擴增前測定其含量和純度，并在測量后調(diào)整DNA濃度至同一水平，這樣可很大限度減少上樣誤差。另外，為保證檢測Ct的一致性，每次檢測都應將標準品和檢測樣品DNA同時上機，通過標準品的回歸標準曲線來對樣品中動物源性成分進行定量。以前的研究中，雖有采用熒光PCR對動物源成分進行定量檢測的方法，但這些報道均未具體描述對樣品和標準品的前處理過程，只是對DNA的濃度進行定量。本研究則以制備的不同百分含量的牛肉粉作為標準品，同時將被檢樣品凍干粉碎，提取DNA繪制標準曲線實現(xiàn)牛源成分的定量，對模擬樣品和送檢牛肉的檢測結(jié)果顯示，比較準確的實現(xiàn)了模擬樣品和送檢牛肉中牛源成分的定量。

有研究表明肌肉生長抑制素基因在哺乳動物和禽細胞中的拷貝數(shù)比較固定［2］。為監(jiān)控核酸擴增中的誤差，本研究使用了肌肉生長抑制素基因作為內(nèi)對照，有效校正了擴增過程中產(chǎn)生的誤差，取得滿意效果。可以進一步應用本研究的思路開展其他動物源成分的定量檢測。由于本研究所檢測的樣品均為生的動物產(chǎn)品，DNA基本未被破壞，因此效果較好。有研究表明深加工的熟制動物產(chǎn)品如阿膠等，其DNA破壞比較嚴重［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)同樣的問題，對于這樣的動物產(chǎn)品，本研究建立的定量方法可能并不適用，需要針對其他類型靶標（如某種相關(guān)的蛋白分子）研究定量檢測方法。本研究僅是對模擬混合牛肉和送檢牛肉進行了檢測，樣品均為生鮮肉，距離作為標準方法還有一定距離，進一步擴大檢測樣品類型，特別是增加一些非深加工的熟肉制品，其他類型組織來驗證方法對有效性將是下一步的研究目標。此外，牛肉脂肪含量相對較低，DNA分布比較均勻，可能也是取得滿意結(jié)果的原因之一，對于脂肪含量高且分布不均勻的動物源性成分能否采用本檢測方法的策略也需要進一步研究確認。

4 結(jié)論

選取牛衛(wèi)星IV DNA和肌肉生長抑制素基因（內(nèi)對照）的作為檢測目標，建立了雙重熒光定量PCR檢測方法，并使用含100%、50%、25%、10%、1%及0.1%牛源成分的凍干肉粉作為定量標準品，對自制混合肉品和送檢肉品中牛源成分進行了定量檢測，取得預期結(jié)果。