介孔二氧化硅介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李舒婷 賀萬(wàn)崇 黃昆侖，2 許文濤，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

介孔二氧化硅納米粒子（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）是一種表面多孔的無(wú)機(jī)納米粒子。其具有很多特性，包括：粒子和孔的大小、粒子形狀、多孔結(jié)構(gòu)的可調(diào)節(jié)性，可進(jìn)行表面修飾，良好的生物相容性，以及大的表面積和孔體積。MSNs有多種形狀，可為圓形、桿形或蠕蟲(chóng)形等，但圓形的MSNs目前研究的相對(duì)較廣［1］?？赏ㄟ^(guò)在MSNs介孔中封裝上不同的客體分子。例如，信號(hào)分子、藥物和基因，表面修飾上不同的基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)各種功能的轉(zhuǎn)變。

功能核酸（Functional nucleic acids，F(xiàn)NA）可以分為天然和人工合成兩種，天然的FNA包括核酶、核糖開(kāi)關(guān)等，人工合成FNA包括適配體、核酶、脫氧核酶及G-四鏈體等［2］。FNA不僅具有催化功能，也能夠與配體結(jié)合［3］，其中適配體可特異性的識(shí)別非靶核酸物質(zhì)［4］。

功能核酸檢測(cè)技術(shù)是目前主流的檢測(cè)技術(shù)之一，而納米材料與功能核酸相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)更是檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。現(xiàn)在，MSNs與FNA相結(jié)合主要應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域作為抗癌藥物或基因的遞送載體實(shí)現(xiàn)藥物或基因的靶向運(yùn)輸。而將這兩者制成生物傳感器運(yùn)用到檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域主要是通過(guò)在MSNs表面修飾上化學(xué)基團(tuán)，將FNA共價(jià)結(jié)合或靜電吸附在MSNs表面作為封端劑，F(xiàn)NA在外界物理、化學(xué)等因素的刺激下改變構(gòu)像或從MSNs表面脫離實(shí)現(xiàn)介孔中客體分子的可控釋放，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)、電信號(hào)等達(dá)到檢測(cè)的目的。

目前，有相關(guān)綜述論述了MSN的合成、藥物遞送、基因遞送及其相關(guān)應(yīng)用等［1，5］。本文將著重綜述近幾年來(lái)介孔二氧化硅介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)，旨為進(jìn)一步探究該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 介孔二氧化硅納米粒子的基本屬性、制備及應(yīng)用

1.1 介孔二氧化硅納米粒子的基本屬性

MSNs是一種表面多孔的無(wú)機(jī)納米粒子，其粒徑在幾十到幾百納米之間不等，孔洞直徑一般為幾納米。MSNs粒子以及介孔表面均帶有負(fù)電荷［6］。Keasberry等［5］在以MSNs為載體向細(xì)胞內(nèi)遞送核酸時(shí)指出，可以通過(guò)將一些帶正電荷的末端基團(tuán)修飾在MSNs表面或在其表面結(jié)合帶有末端氨基的小分子或脂類使MSNs表面帶正電荷，易于與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合。除此之外，MSNs還具有良好的表面化學(xué)特性，這使得其表面易于被聚陽(yáng)離子修飾［7］，如在MSNs表面修飾碳硅烷樹(shù)突狀分子作為寡核苷酸鏈的遞送載體［8］。另外，MSNs表面也易被官能化，如形成 MSN-NH2、MSN-COOH［9］、MSN-N3和 MSNCl［10］等。

1.2 介孔二氧化硅納米粒子的制備方法

1.2.1 一般介孔二氧化硅納米粒子的制備 制備MSNs的方法有多種，目前應(yīng)用最廣泛的是溶膠-凝膠法［1，9，11］。Wu 等［12］指出，性能優(yōu)良的 MSNs應(yīng)具有以下幾個(gè)特性：一是能夠穩(wěn)定懸浮于溶液中；二是具有可控的孔徑；三是粒徑均勻且孔洞體積大。一個(gè)MSNs懸浮良好的溶液可以應(yīng)用到光譜技術(shù)中并大大減少光的散射，通過(guò)精確調(diào)節(jié)孔徑大小可選擇性的裝載生物聚合物。此外，控制MSNs顆粒大小可以精確定量需要攜帶的貨物，而孔體積大（即納米粒子壁相對(duì)較?。┑腗SNs則更易被生物降解。另外，他們還介紹了用改進(jìn)Stober法來(lái)合成MSNs，這種方法制備的MSNs具有統(tǒng)一的粒子大小。Tang等［1］在概述MSNs的制備方法時(shí)指出MSNs的孔洞的大小和形狀主要取決于表面活性劑模板的性質(zhì)；可以通過(guò)調(diào)整二氧化硅前體物質(zhì)和表面活性劑的比例，使用堿性催化劑控制pH值以及添加共溶劑和有機(jī)溶脹劑來(lái)調(diào)控粒子的大小和形狀，粒子可為圓形、棒形和蠕蟲(chóng)形等。對(duì)于制備中空MSNs，一般為雙模板法；同時(shí)，Tang等也提出了如軟模板法、自我模板法等新的MSNs的制備方法。

1.2.2 磁性介孔二氧化硅復(fù)合納米粒子的制備 2017年，Bazmandegan-Shamili等［13］制備了具有較強(qiáng)的吸附能力的磁性介孔二氧化硅（Magnetic mesoporous silica，MMS）并將其應(yīng)用于殺蟲(chóng)劑的固相微萃取。在制備MMS過(guò)程中，作者在Fe3O4表面覆蓋一層SiO2，以此復(fù)合粒子作為核，再利用傳統(tǒng)的溶膠-凝膠法在核的外面包裹一層介孔二氧化硅就形成了所需的MMS。Lu等［14］采用濕化學(xué)法合成氨化的磁性介孔二氧化硅納米粒子，此納米粒子的中心同樣是Fe3O4。在合成過(guò)程中需要利用正硅酸乙酯（Tetraethyl orthosilicate，TEOS）和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltrie-thoxysialane，APTES）的水解和縮合。Snoussi等［15］則借助于超聲波化學(xué)合成了一種核/雙殼結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料：Fe3O4@NH2-mesoporous silica@Polypyrrole/Pd。

雖然不同的研究者在制備MSNs的過(guò)程中存在一定的差異，但都離不開(kāi)表面活性劑作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑，且大多數(shù)為CTAB，少數(shù)為P123。此外，TEOS常被用來(lái)作為MSNs的前體物質(zhì)。

1.3 介孔二氧化硅納米粒子常見(jiàn)的應(yīng)用領(lǐng)域

目前，MSNs已經(jīng)被科學(xué)家應(yīng)用到各個(gè)方面。其中，應(yīng)用最廣泛的則是將MCM-41，MCM-48和SBA-15這3種類型的MSNs作為藥物和基因的遞送載體，研發(fā)可控藥物釋放系統(tǒng)，用于疾病治療［1］。2012年，Li等［6］在研究納米機(jī)器用于癌癥治療時(shí)，研制出了一種光控介孔藥物釋放系統(tǒng)，這種系統(tǒng)是基于偶氮苯修飾的核酸控制。偶氮苯的異構(gòu)化可以誘導(dǎo)互補(bǔ)DNA雜交和去雜交，從而控制MSNs孔門的開(kāi)閉；在可見(jiàn)光波長(zhǎng)下，偶氮苯為反式結(jié)構(gòu)，DNA雜交，孔處于關(guān)閉狀態(tài)，藥物被截留，紫外光波長(zhǎng)下，偶氮苯為順式結(jié)構(gòu)，DNA去雜交，孔打開(kāi)，藥物得到釋放。Bertucci等［16］利用MSNs聯(lián)合遞送替莫唑胺（抗癌藥物）和抗miR221的聚精氨酸-肽核酸（R8-PNA）誘導(dǎo)耐藥神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，R8-PNA通過(guò)靜電相互作用固定在MSNs表面。另外，Li等［17］將連接有咪唑樹(shù)枝大分子的介孔二氧化硅納米粒子用于阿霉素和生存素shRNA表達(dá)質(zhì)粒的共同遞送，協(xié)同治療癌癥。Li等［18］則利用葉酸功能化的磁性介孔二氧化硅納米粒子實(shí)現(xiàn)藥物和核酸的共遞送以增強(qiáng)抗腫瘤功效。該納米復(fù)合粒子具有葉酸受體靶向和磁性靶向的雙靶向功能，通過(guò)葉酸受體介導(dǎo)的途徑進(jìn)入細(xì)胞，能夠同時(shí)遞送阿霉素和VEGF shRNA。

此外，Zhang等［19］用聚乙烯亞胺修飾MSNs表面，使其表面氨基化，通過(guò)靜電吸引將pDNA固定在MSNs表面從而實(shí)現(xiàn)基因的遞送用于疾病治療。Chen等［9］使用DNA作為一種基于生物分子的質(zhì)子響應(yīng)帽系統(tǒng)用于MSNs，設(shè)計(jì)出了一種PH刺激智能響應(yīng)性門控釋放機(jī)制。Pu等［20］構(gòu)建出了第一個(gè)基于MSNs和DNA的鍵盤鎖系統(tǒng)，基于邏輯控制，他們使用DNA鏈置換來(lái)觸發(fā)包埋在MSNs孔中的客體分子的釋放。也有研究者利用核酸適配體封蓋的MSNs構(gòu)建了一種新型、簡(jiǎn)便及免標(biāo)記的肌紅蛋白定量檢測(cè)方法，檢出限為1.1 nmol/L，低于臨床醫(yī)學(xué)診斷臨界值（5 nmol/L）［21］。

2 介孔二氧化硅納米粒子上修飾功能核酸的方法

各種功能核酸與MSNs的結(jié)合方式也存在差異。如：C四聯(lián)體（具有胞嘧啶堿基序列的四鏈DNA結(jié)構(gòu)）通過(guò)酰胺鍵與MSNs進(jìn)行連接［9］，單鏈DNA也可以通過(guò)酰胺鍵等共價(jià)鍵固定在MSNs表面［11，22］。Li等［17］先用氰酰對(duì)MSNs進(jìn)行表面修飾，然后將帶有氨基的單鏈DNA（ssDNA）與氰?；Y(jié)合，通過(guò)酰胺鍵將ssDNA固定在MSNs表面。Li等［6］對(duì)MSNs在水溶液中吸附DNA的機(jī)理進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，DNA與硅表面結(jié)合的驅(qū)動(dòng)力主要有3部分：一是靜電屏蔽效應(yīng)；二是脫水作用；三是分子間氫鍵，并且DNA是單層吸附于MSNs的表面。此外，增加鹽的濃度和降低PH值可以促進(jìn)DNA吸附在MSNs表面。另外，也可以通過(guò)靜電吸附作用將寡核苷酸鏈固定在MSNs表面［23-24］。

3 介孔二氧化硅-功能核酸熒光生物傳感器

在將MSNs和FNA結(jié)合運(yùn)用到熒光生物傳感器的過(guò)程中，大部分科學(xué)家偏向于利用FNA作為封端劑，將熒光劑封裝在介孔中，當(dāng)靶物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，可與MSNs表面的FNA結(jié)合使孔打開(kāi)釋放出熒光劑，通過(guò)測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步確定靶物質(zhì)的含量。Climent等［23］利用MSNs介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)支原體的檢測(cè)。他們將MCM-41作為載體，用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）對(duì)其進(jìn)行表面修飾，因氨丙基在中性水中帶有部分正電荷，帶有負(fù)電荷的寡核苷酸鏈可以與其發(fā)生相互作用從而固定在MCM-41表面使孔處于關(guān)閉狀態(tài)，將若丹明B熒光染料截留在孔內(nèi)。當(dāng)支原體基因組DNA出現(xiàn)時(shí)，寡核苷酸鏈與其互補(bǔ)配對(duì)，從MCM-41表面脫離，孔打開(kāi)，若丹明B染料得以釋放。通過(guò)測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)于支原體基因組的定量檢測(cè)。該檢測(cè)技術(shù)與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）具有相似的選擇性，但更簡(jiǎn)單、高效、成本更低，可避免PCR信號(hào)放大過(guò)程中由于錯(cuò)誤復(fù)制而導(dǎo)致對(duì)結(jié)果的干擾。Wang等［25］首次制備出了表面連接有序核酸聚集體（Orderly nucleic acid aggregates，ONAAs）的 MSNs（ONAAs-PCMSN），并基于利用ONAAs-PCMSN的非破壞性擴(kuò)增策略開(kāi)發(fā)出了用于miRNA檢測(cè)和活細(xì)胞中熒光亮點(diǎn)的原位成像技術(shù)。該檢測(cè)方法可以通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET） 有效地將信號(hào)放大（圖1）。該方法測(cè)得的熒光強(qiáng)度與miRNA濃度的對(duì)數(shù)具有很好的線性關(guān)系，檢測(cè)線低，特異性高，有好的可重復(fù)性。這也為特異核酸序列的檢測(cè)提供了一個(gè)新的檢測(cè)方法。Borsa等［26］通過(guò)二氧化硅磁納米顆粒-MSN/寡核苷酸綴合物聯(lián)用來(lái)檢測(cè)血液樣品中的金黃色葡萄球菌。此外，Chen等［27］首次利用點(diǎn)擊化學(xué)（即Cu（I）催化炔-疊氮環(huán)加成反應(yīng)）技術(shù)將含有凝血酶適配體的雙鏈DNA（dsDNA）固定在裝載了熒光劑FITC的MSNs表面，設(shè)計(jì)了一種刺激響應(yīng)性熒光生物傳感器用于血清中凝血酶的檢測(cè)。這種利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的加蓋過(guò)程幾乎實(shí)現(xiàn)了FITC的零泄漏。

圖1 在單細(xì)胞中通過(guò)靜電自主裝形成有序核酸聚集體用于miRNA 檢測(cè)［25］

4 介孔二氧化硅-功能核酸電化學(xué)生物傳感器

在介孔二氧化硅介導(dǎo)的功能核酸電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用中，雖然檢測(cè)方法有所不同，但研究者基本都采用具有電活性的亞甲基藍(lán)（Methylene blue，MB）作為信號(hào)分子來(lái)監(jiān)測(cè)被檢物質(zhì)的濃度變化。如Liu等［28］基于G-四鏈體DNA功能化的MSNs和亞甲基藍(lán)作為信號(hào)分子開(kāi)發(fā)了電化學(xué)生物傳感器測(cè)定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性。其中G-四鏈體DNA作為鎖控制MB的釋放。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶含量越多、活性越高，釋放的MB信號(hào)分子越多；信號(hào)分子的含量可轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電流信號(hào)進(jìn)行顯示。該方法具有選擇性高、方便、成本低以及快速等優(yōu)點(diǎn)，除可用于檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性外也可用于篩選DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。Gan等［29］設(shè)計(jì)了一種基于G-四鏈體/氯高鐵血紅素功能化的并嵌入MB的MSN的多重放大無(wú)酶電化學(xué)免疫傳感器用于檢測(cè)微囊藻毒素-LR（MC-LR）。隨著溶液中MC-LR濃度的升高，電化學(xué)信號(hào)逐漸降低（圖2）。該方法的檢測(cè)限是0.3 ng/L，相較于Zhao等［30］的檢測(cè)方法靈敏度有所提高但設(shè)計(jì)更加復(fù)雜。

圖2 MC-LR電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建［29］

2017年，Wang等［31］利用富含胸腺嘧啶（T）的ssDNA來(lái)封蓋MSNs制成電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)谷胱甘肽（GSH）。其中，固定在MSNs表面的ssDNA在加入Hg2+之后通過(guò)T-Hg2+-T錯(cuò)配形成雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA/T-Hg2+-T復(fù)合物將電活性的MB封在介孔中，當(dāng)靶物質(zhì)GSH出現(xiàn)時(shí)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性位移反應(yīng)形成GSH-Hg2+，雙鏈結(jié)構(gòu)DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂?，孔打開(kāi)，釋放MB，利用正十二烷醇修飾的SPE電極轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏餍盘?hào)，以此來(lái)檢測(cè)GSH的含量變化。

5 介孔二氧化硅-功能核酸化學(xué)發(fā)光生物傳感器

對(duì)于介孔二氧化硅-功能核酸生物傳感器，化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備研究較少，而可視化生物傳感器還未見(jiàn)報(bào)道。2016年，Chen等［32］設(shè)計(jì)了基于刺激響應(yīng)MSNs的化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于可卡因的檢測(cè)。研究者將可卡因核酸適配體作為封端劑，葡萄糖作為客體分子封裝在MSNs介孔中，當(dāng)靶物質(zhì)可卡因出現(xiàn)時(shí)與適配體結(jié)合，適配體從單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榍o狀結(jié)構(gòu)，孔打開(kāi)，葡萄糖分子釋放出來(lái)，在葡萄糖氧化酶作用下與溶液中溶解的O2反應(yīng)生成H2O2，H2O2進(jìn)一步與溶液中魯米諾發(fā)生氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光。根據(jù)化學(xué)發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)判斷可卡因的含量。該傳感器檢測(cè)限為1.43 μM，相較于之前報(bào)道過(guò)的一些方法，該方法具有更高的靈敏度。

6 介孔二氧化硅-金屬納米粒子功能核酸生物傳感器

目前，有很多科學(xué)家將金屬納米粒子應(yīng)用到介孔二氧化硅-功能核酸生物傳感器中作為封端材料或催化劑等。Chen等［11］設(shè)計(jì)出了一種PH驅(qū)動(dòng)的響應(yīng)控制釋放DNA納米開(kāi)關(guān)，其中一條DNA鏈與Au-NPs相結(jié)合，作為MSNs封端劑，控制孔中貨物分子的釋放。堿性條件下，兩條DNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，孔被Au-NPs堵住，貨物分子被截留在孔內(nèi)，酸性環(huán)境下，結(jié)合有Au-NPs的ssDNA形成四鏈體結(jié)構(gòu)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，孔打開(kāi)，貨物分子得到釋放。此納米開(kāi)關(guān)具有良好的封閉效果，且該系統(tǒng)靈敏、快速、能夠?qū)崿F(xiàn)精確控制。Wang等［24］利用鉑納米粒子（Pt-NPs）可催化無(wú)色的四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）氧化生成藍(lán)色的氧化TMB（oxTMB）的特性，將Pt-NPs與MSNs相結(jié)合來(lái)無(wú)標(biāo)記檢測(cè)DNA。Pt-NPs在MSNs的中心通過(guò)介孔與外界相通，寡核苷酸鏈通過(guò)靜電作用吸附在Pt@mSiO2表面將孔堵住，當(dāng)靶DNA鏈出現(xiàn)時(shí)，Pt@mSiO2表面的寡核苷酸鏈與其互補(bǔ)配對(duì)從Pt@mSiO2表面脫離，孔打開(kāi)，溶液中的TMB進(jìn)入孔中與Pt-NPs接觸觸發(fā)氧化反應(yīng)變?yōu)樗{(lán)色的oxTMB?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)溶液中oxTMB的吸光度來(lái)實(shí)現(xiàn)靶DNA的定量測(cè)定。該方法免去了標(biāo)記DNA過(guò)程的繁瑣，并具有良好的單堿基對(duì)錯(cuò)配鑒別能力，但是線性范圍較窄，而且為了使Pt@mSiO2表面吸附的核酸鏈飽和，核酸的濃度必須達(dá)到Pt@mSiO2濃度的60倍左右。

圖3 Fe3O4@nSiO2@mSiO2-T-TRDNA的合成過(guò)程以及檢測(cè)和去除Hg2+的原理［33］

7 磁性介孔二氧化硅-功能核酸生物傳感器

在磁性介孔二氧化硅納米粒子（MMSNs）的制備中，一般采用Fe3O4作為磁性核形成復(fù)合納米粒子。利用MMSNs的強(qiáng)趨磁性可以實(shí)現(xiàn)該納米粒子簡(jiǎn)便、快速的富集。例如，He等［33］將Fe3O4外面包裹一層無(wú)孔二氧化硅作為核，再在其外面覆蓋一層介孔二氧化硅形成一種核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子（Fe3O4@nSiO2@mSiO2），然后在這種納米粒子外表面修飾上富含T核苷酸的ssDNA，孔內(nèi)表面修飾上大量T核苷酸形成復(fù)合納米粒子（Fe3O4@nSiO2@mSiO2-TTRDNA）。研究者利用該種納米粒子構(gòu)建熒光生物傳感器以檢測(cè)和去除樣品中的Hg2+（圖3）。

Xiong等［34］設(shè)計(jì)合成了一種適配體固定化的磁性介孔二氧化硅-金納米粒子復(fù)合物用于人類血清中胰島素的檢測(cè)。通過(guò)固定在孔內(nèi)Au-NPs上的適配體來(lái)捕獲胰島素，將胰島素包裹在介孔中，然后利用納米復(fù)合物的強(qiáng)趨磁性進(jìn)行富集，分離出胰島素，再利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）來(lái)檢測(cè)溶液中胰島素的含量。該方法成功降低了復(fù)雜介質(zhì)中背景信號(hào)的干擾，并且具有較高的選擇性和靈敏度。最近，Lu等［14］基于MMSNs設(shè)計(jì)出了一種可控響應(yīng)性釋放MB+的電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)端粒酶活性并可用于篩選端粒酶抑制劑。該MMSNs也屬于核-殼結(jié)構(gòu)，磁核/介孔殼即Fe3O4/SiO2。利用MMSNs磁性可以更加方便的將制備的DNA-MMSN-MB+從溶液中分離出來(lái)同時(shí)減少在分離過(guò)程中使DNA分子門打開(kāi)造成相應(yīng)背景信號(hào)增強(qiáng)對(duì)結(jié)果的干擾，提高靈敏度。

8 介孔二氧化硅-功能核酸介導(dǎo)的藥物靶向運(yùn)輸

MSNs作為藥物遞送載體用于靶向治療癌癥的研究有很多，介孔二氧化硅-功能核酸介導(dǎo)的藥物靶向運(yùn)輸同樣得到了許多研究者的關(guān)注。Wang等［35］通過(guò)靜電吸引力將ssDNA固定在經(jīng)葉酸（FA）修飾的MSNs表面作為門控，將阿霉素（DOX，抗癌藥物）封裝在介孔中。由于癌細(xì)胞表面的FA受體過(guò)表達(dá)，DNA/MSN/FA/DOX系統(tǒng)可以經(jīng)過(guò)FA受體介導(dǎo)進(jìn)入癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)藥物的靶向運(yùn)輸，但需要與ATP介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增合成物經(jīng)FA受體介導(dǎo)共同進(jìn)入癌細(xì)胞，才能實(shí)現(xiàn)藥物釋放。隗予榮等［36］設(shè)計(jì)了一種靶向可控釋放的藥物運(yùn)載體系，該體系中將介孔二氧化硅包裹在稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面，再在介孔二氧化硅表面修飾上可特異性識(shí)別人急性淋巴白血病細(xì)胞上PTK7蛋白的核酸適配體用于藥物的靶向運(yùn)輸。Pascual等［37］將MUC1適配體（MUC1是一種乳腺癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)）作為MSNs介孔的封蓋物質(zhì)實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，該研究者用APTES修飾MSNs使其表面帶有氨丙基，通過(guò)靜電相互作用與氫鍵連接從而將適配體固定在MSNs表面，在適配體的作用下實(shí)現(xiàn)藥物的靶向運(yùn)輸。

9 介孔二氧化硅用于生物成像

研究者將MSNs應(yīng)用于生物成像時(shí)，會(huì)在MSNs中參雜特定的金屬離子，利用金屬離子的熒光特性或核磁共振效應(yīng)等實(shí)現(xiàn)生物成像。Freitas等［38］設(shè)計(jì)了一種表面修飾有銅離子的多功能介孔二氧化硅。他們?cè)贛SNs表面修飾了APTES，然后利用酰胺鍵進(jìn)一步將DTPA螯合物固定在MSNs上，銅離子通過(guò)與DTPA反應(yīng)引入到MSNs表面。銅離子可在核反應(yīng)堆中活化為放射性同位素64Cu為進(jìn)一步將該復(fù)合納米粒子用于PET成像提供了基礎(chǔ)。Hsiao等［39］同樣設(shè)計(jì)出了一種多功能MSNs，可在靶向癌癥治療中實(shí)現(xiàn)雙核磁共振和熒光成像，用于成像指導(dǎo)性癌癥治療，研究者將鑭系金屬離子中的Eu3+和 Gd3+參雜在MSNs中。其中，Eu3+可以發(fā)射強(qiáng)烈的紅色熒光；而Gd3+具有順磁性官能團(tuán)，高磁通量和較長(zhǎng)的自旋晶格弛豫時(shí)間（T1），這使得Gd3+能夠核磁共振成像增強(qiáng)光致熒光的敏感性進(jìn)一步增強(qiáng)Eu3+的紅色發(fā)光。

此外，Shi等［40］以MSNs為結(jié)構(gòu)框架構(gòu)建了一種新型近紅外熒光納米粒子（mSiO2@Gd3Ga5O12：Cr3+，Nd3+）作為多功能納米平臺(tái)用于多模式成像和癌癥治療。在該納米粒子中含有Cr3+、Nd3+和Gd3+，其中，Cr3+在254 nm紫外光激發(fā)下在近紅外I區(qū)745 nm處可持續(xù)發(fā)光，Nd3+在808 nm波長(zhǎng)激發(fā)下在近紅外II區(qū)1 067 nm處可持續(xù)發(fā)光，并且Gd3+具有優(yōu)異的核磁共振效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了多模式成像。此外該納米粒子的持續(xù)發(fā)光信噪比高，在體內(nèi)成像持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。Wang等［41］將ICG和W18O49共同封裝在MSNs中構(gòu)建了一種直徑約200 nm的熒光載體（ICG+WO）@MSN）并將該載體用于光熱療法的實(shí)時(shí)跟蹤（圖4）。用波長(zhǎng)為808 nm的近紅外光照射該粒子時(shí)，（ICG+WO）@MSN中的WO可將吸收的近紅外光轉(zhuǎn)化為熱殺死癌細(xì)胞，而ICG可發(fā)射熒光有利于體內(nèi)實(shí)時(shí)成像。（ICG+WO）@MSN的構(gòu)建用于ICG成像引導(dǎo)的光熱療法，可以精確殺死癌細(xì)胞，為癌癥治療提供了良好平臺(tái)。另外，An等［42］也成功設(shè)計(jì)出了一種具有靶向化學(xué)-光熱療法和腫瘤PA/CT成像雙功能的新型納米探針（GMS/DOX@SLB-FA）。

圖4 （ICG+WO）@MSN的合成及其在光熱療法中的應(yīng)用［41］

10 介孔二氧化硅的基因毒性

已有研究者對(duì)MSNs的基因毒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MSNs具有一定的毒性，但與其他無(wú)機(jī)納米材料相比較，毒性相對(duì)較低。Quanan等［43］在對(duì)MSNs在人胚腎293（HEK293）細(xì)胞中的遺傳毒性進(jìn)行探究時(shí)發(fā)現(xiàn)：MSNs可以抑制或促進(jìn)某些人類基因的表達(dá)，其中一些基因可能在細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起重要作用；MSNs會(huì)引起HEK293細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和DNA降解；但在EGFR或KRAS基因中并未發(fā)現(xiàn)突變，實(shí)驗(yàn)中所用染色體3、7和17也并未檢測(cè)到變化，HER2，EGFR或TERC基因也沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增。這些研究結(jié)果表明暴露于MSNs對(duì)正常人類細(xì)胞具有遺傳毒性，特別是會(huì)改變一些重要基因的表達(dá)，這種遺傳毒性可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和某些良性疾病，但未證明暴露于MSNs會(huì)誘導(dǎo)與致癌相關(guān)的嚴(yán)重基因毒性，例如DNA突變或染色體變化等。2016年，Niu等［44］研究了MSNs的形狀依賴性基因毒性并建立了一個(gè)納米粒子高通量篩選方法。他們得出球形和桿形MSNs都具有細(xì)胞毒性，且桿形相較于球形作用效果更嚴(yán)重。此外，與修復(fù)精通型細(xì)胞相比，MSNs在修復(fù)缺陷型細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化損傷和更大數(shù)量的有絲分裂的染色體畸變。

11 展望

目前，MSNs與FNAs相結(jié)合應(yīng)用的方式主要是兩種，一是FNA固定在被修飾MSNs表面作為封端劑，控制孔中客體分子進(jìn)出；二是FNA作為客體封裝在MSN的介孔中進(jìn)行應(yīng)用。其中，將FNA固定在MSNs表面進(jìn)行應(yīng)用的研究相對(duì)較多，而第二種方式相對(duì)較少，這可能會(huì)成為未來(lái)的研究趨勢(shì)。雖然，MSNs具有一定的毒性，但相較于其他的納米材料毒性相對(duì)較低，如果能較好地控制MSNs的量，毒性還是能夠得到很好的控制。但要利用MSNs在人體內(nèi)發(fā)揮作用，其毒性還有待進(jìn)一步研究。此外，目前MSNs與FNA相結(jié)合的應(yīng)用研究基本都存在線性范圍較窄等缺點(diǎn)，這是今后開(kāi)發(fā)介孔二氧化硅介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)需要克服的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

Li等［6］科學(xué)家研制出的光控釋放系統(tǒng)具有很多顯著的優(yōu)點(diǎn)，首先運(yùn)動(dòng)和構(gòu)像容易控制；此外對(duì)于遠(yuǎn)程控制能力，輻照是一個(gè)準(zhǔn)確且簡(jiǎn)單的方法；并且它是一種清潔能源，可以反復(fù)快速應(yīng)用而不會(huì)損失效率。Kne?evi?等［45］對(duì)大孔介孔二氧化硅（LPMSN）在生物分子運(yùn)輸方面的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，說(shuō)道LPMSN對(duì)于大的藥物分子，蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)入或離開(kāi)孔隙系統(tǒng)的傳質(zhì)、擴(kuò)散和滲透能力比較小孔隙的MSNs更有優(yōu)勢(shì)；并且在大分子吸附解吸過(guò)程中不會(huì)改變LPMSN的活性。

MSNs合成靈活、可規(guī)?；a(chǎn)且成本低，是未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［1］。此外，利用磁性介孔二氧化硅的趨磁性能夠?qū)崿F(xiàn)被檢物質(zhì)簡(jiǎn)便、快速的富集和分離。在實(shí)際應(yīng)用中，如果能將大孔磁性介孔二氧化硅與功能核酸相結(jié)合設(shè)計(jì)一種光響應(yīng)性可控釋放系統(tǒng)用于生物傳感器的構(gòu)建，并用來(lái)檢測(cè)生物活性物質(zhì)、環(huán)境污染物等，相信這種介孔二氧化硅介導(dǎo)的功能核酸檢測(cè)技術(shù)會(huì)有很廣泛的應(yīng)用前景。