外切酶III介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器研究進(jìn)展

宋歡 羅云波 許文濤

（1. 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

在傳統(tǒng)生物學(xué)的概念中，DNA的主要功能是儲(chǔ)存遺傳信息。然而早在1982年，Seeman［1］就提出，DNA所特有的分子識(shí)別性質(zhì)或許可以用于完全非生物的環(huán)境中。人們從1990年開始對(duì)包括適配體和Ribozyme在內(nèi)的功能核酸進(jìn)行研究和探索［2］。從此，功能核酸成為感知應(yīng)用領(lǐng)域中極具吸引力的檢測(cè)工具，可源于自然，或是通過隨機(jī)的核酸庫人工篩選出來［3］。功能核酸作為靶物質(zhì)的識(shí)別分子，與信號(hào)轉(zhuǎn)換和輸出系統(tǒng)構(gòu)成生物傳感器的3大組成要素［4］。與傳統(tǒng)的分析方法相比，功能核酸生物傳感器因其靈敏度高、選擇性好、所需時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單和檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，極大地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)和藥物篩選的發(fā)展。

近年來，為了實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測(cè)，人們將不同的信號(hào)放大策略整合到傳感器的設(shè)計(jì)中，包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［5］、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）［6］、滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）［7］、鏈置換反應(yīng)［8］和酶催化反應(yīng)［9］等。盡管這些技術(shù)的運(yùn)用能夠?qū)鞲衅鞯撵`敏性提高到一定程度，但也免不了存在些不足，如靈敏性有限、程序繁瑣等。但是，工具酶的高靈敏性和特異性、操作簡(jiǎn)單以及反應(yīng)條件溫和的特性能很好的彌補(bǔ)這些不足，其介導(dǎo)的信號(hào)放大技術(shù)在生化分析中得到了快速發(fā)展，這些工具酶包括序列依賴的限制性內(nèi)切酶、切刻酶，以及非序列依賴的RNase H、外切酶、雙鏈特異性核酸酶、AP（Apurinic/apyrimidinic，脫嘌呤/脫嘧啶）內(nèi)切酶和DNase I等［10］。尤其是Exo III，作為一種不需要特殊識(shí)別位點(diǎn)，并且有著高效穩(wěn)定的切割活性的核酸酶，已經(jīng)被廣泛用于靶物質(zhì)的信號(hào)循環(huán)放大過程。Exo III的最佳底物是dsDNA平末端或3′凹端，對(duì)ssDNA和3′端含有4個(gè)以上單核苷酸凸起的dsDNA活性很低，早期被用于DNA測(cè)序［11-12］，后來隨著功能核酸生物傳感器的不斷發(fā)展，將Exo III與功能核酸搭配使用，可將非核酸信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)，搭載各種信號(hào)輸出和放大方式，實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的快速精準(zhǔn)檢測(cè)。因此，Exo III在功能核酸生物傳感器的研究應(yīng)用中占據(jù)十分重要的地位。本文對(duì)Exo III的不同性質(zhì)進(jìn)行介紹，并根據(jù)靶物質(zhì)不同對(duì)Exo III介導(dǎo)的生物傳感器進(jìn)行分類綜述。此外，還對(duì)Exo III結(jié)合其他信號(hào)放大策略或納米材料的生物傳感器進(jìn)行較為詳細(xì)的介紹，旨在使人們更多地了解Exo III在生物傳感器中的應(yīng)用特點(diǎn)和發(fā)展現(xiàn)狀，為今后所用。

1 Exo III與核酸相互作用的酶活性質(zhì)

Exo III是分子量為28 kD的單體蛋白質(zhì)，沉降系數(shù)（S20，w）為 2.92并且是球形的（f/fo = 1.15）［13］。Mol等［14］報(bào)道了Exo III的1.7 A高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有2倍對(duì)稱、4層αβ折疊結(jié)構(gòu)，與DNase I和RNase H的結(jié)構(gòu)有相似之處。Exo III可以催化dsDNA中幾種磷酯鍵的水解，包括3′-5′外切酶活性、3′磷酸酶活性和AP內(nèi)切酶活性（圖1）。另外，還具有RNase H活性。下面將對(duì)這幾種主要的活性進(jìn)行較為詳細(xì)的介紹。

1.1 磷酸酶活性

Exo III在大腸桿菌中被大量純化，最開始被鑒定為一種磷酸酶。在磷酸鉀緩沖液中，Exo III發(fā)揮磷酸酶活性的最佳pH為6.8-7.4；在Tris-馬來酸鹽緩沖液中，最佳pH為6.7-7.0，兩種緩沖液達(dá)最大磷酸酶活性的pH均為7左右［15］。此外，Mg2+對(duì)Exo III磷酸酶的活性具有十分重要的作用，在缺少M(fèi)g2+的條件下，磷酸酶活性只達(dá)最大酶活的5%，其他二價(jià)陽離子如Ca2+和Zn2+無法取代Mg2+的作用；且當(dāng)Mg2+處于濃度最優(yōu)時(shí)，Zn2+的添加會(huì)導(dǎo)致磷酸酶的酶活抑制［15］。Richardson 等［16］證明 Exo III只有將dsDNA的3′磷酸基團(tuán)移除之后，才能從3′端逐步釋放出5′核苷酸，發(fā)揮外切酶的活性。

1.2 外切酶活性

Exo III對(duì)dsDNA具有水解專一性，當(dāng)dsDNA存在時(shí)，Exo III催化dsDNA分子從3′末端進(jìn)行逐步水解［16］。該酶的最適底物為平末端或者3′凹端的dsDNA［17］。在消化過程中，部分水解的dsDNA產(chǎn)生凸出的5′尾巴，雙鏈區(qū)域會(huì)越來越短，直到?jīng)]有足夠的堿基數(shù)量維持堿基對(duì)以保持雙鏈結(jié)構(gòu)。由于ssDNA鏈內(nèi)存在氫鍵，所以Exo III對(duì)ssDNA也具有一定的降解作用，但降解效率遠(yuǎn)低于dsDNA［18］。在dsDNA消化40%-50%之后，由于剩余的DNA幾乎都是單鏈的，因此水解速率會(huì)突然減緩［18］。Wu等［19］證明，在23℃時(shí)，一個(gè)Exo III分子在10 min內(nèi)能夠從DNA的3′端水解100個(gè)核苷酸。5℃時(shí)，在高鹽環(huán)境中，一個(gè)Exo III只能催化一個(gè)dsDNA分子的3′端約6個(gè)核苷酸同步水解；若Exo III與dsDNA分子3′端之比提高到2倍時(shí)，每個(gè)3′末端將有約12個(gè)核苷酸水解［20］。

當(dāng)合成雙鏈由均聚物如（dA）n·（dT）n 或交替共聚物如d（A-T）n組成時(shí)，此時(shí)相關(guān)的動(dòng)力學(xué)與天然來源的DNA不同，因其會(huì)通過氫鍵的自發(fā)斷裂和重組使鏈在彼此之間移動(dòng)，從而維持最大限度的堿基配對(duì)，直到底物被消化的程度接近100%［18］。

1.3 內(nèi)切酶活性

DNA的烷基化主要發(fā)生在鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3位，在中性或酸性環(huán)境中，DNA會(huì)因?yàn)槭ネ榛镍B嘌呤殘基導(dǎo)致單鏈斷開［21］。1969年，F(xiàn)riedberg 和 Goldthwait［22］純化出內(nèi)切酶 II，該酶不僅能夠降解烷基化的DNA，對(duì)天然的T4和T7噬菌體DNA還能夠造成有限的單鏈斷裂［23］。此外，在高純度的內(nèi)切酶II樣品中還發(fā)現(xiàn)了外切酶活性，但當(dāng)時(shí)被誤認(rèn)為是受到外切酶污染的緣故［22］。Yajko和Weiss［24］發(fā)現(xiàn)，Exo III缺陷型的大腸桿菌突變體，其內(nèi)切酶II的活性也同樣受到影響，反之亦然，即Exo III和內(nèi)切酶II的活性具有一定的相關(guān)性。隨后Weiss將純化好的內(nèi)切酶II樣品分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、蔗糖密度梯度離心和凝膠過濾層析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，只要是含有內(nèi)切酶II活性的部分都同樣包含外切酶和DNA-3′-磷酸酶活性，這些活性均來自同一個(gè)單體蛋白Exo III，可能是因?yàn)樵摰鞍椎哪硞€(gè)活性位點(diǎn)能夠通過脫嘌呤或DNA雙鏈自發(fā)的末端解旋從而識(shí)別鏈間區(qū)域［13］。

1.4 RNase H活性［18］

將Exo III的純化產(chǎn)物進(jìn)行凝膠過濾時(shí)，無法將RNase的活性與Exo III的其他酶活區(qū)分開。Poly（rA）·poly（dT）的降解速率是 poly（dA）·poly（dT）的1/5。雜交鏈中RNA鏈的降解比DNA鏈快100倍，同時(shí)缺少任何一條鏈，將無法從另一條鏈檢測(cè)出酶活，這種現(xiàn)象可能是由于Exo III識(shí)別與切割鏈互補(bǔ)的DNA鏈上的脫氧核糖殘基。

圖1 Exo III對(duì)dsDNA的作用類型［18］

2 Exo III介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器

由于Exo III的最佳底物是dsDNA平末端或3′凹端，對(duì)ssDNA和3′端含有4個(gè)以上單核苷酸凸起的dsDNA活性很低，所以在傳感器發(fā)生酶催化反應(yīng)時(shí)，為了保證靶物質(zhì)的完整性，信號(hào)探針參與雜交后應(yīng)為平末端或 3′凹端［10］。

2.1 Exo III介導(dǎo)的microRNA功能核酸生物傳感器的研究進(jìn)展

研究表明，microRNAs可以成為某些疾病如惡性腫瘤的生物標(biāo)志物，microRNAs的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)等具有緊密的聯(lián)系，因此檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的microRNAs對(duì)于癌癥的機(jī)制探索、控制和治療具有很重要的意義［25］。Huang等［26］利用Exo III和石墨烯介導(dǎo)的信號(hào)放大體系設(shè)計(jì)了一個(gè)檢測(cè)microRNAs的生物傳感器（圖2-A）。miRNA-34a與probe DNA互補(bǔ)雜交成pDNA/miRNA-34a，之后Exo III將probe DNA消化成短的寡核苷酸片段，同時(shí)釋放出的miRNA-34a再與完整的probe DNA雜交參與信號(hào)放大過程，而這些短的寡核苷酸（1-4 mer）能夠增強(qiáng)石墨烯上羅丹明6G的電離效率，使信號(hào)增強(qiáng)，這種方法測(cè)得的microRNA濃度能達(dá)到fmol/L水平。

Min等［27］根據(jù)聚集誘導(dǎo)發(fā)光的原理設(shè)計(jì)了一個(gè)具有TPEPy黃色熒光基團(tuán)的超級(jí)耐光DNA探針，對(duì)尿液和活細(xì)胞中的microRNAs進(jìn)行了監(jiān)測(cè)（圖2-B）。反應(yīng)開始時(shí)，microRNA 21與探針的DNA部分雜交形成雙鏈DNA-RNA，由于3′為平末端，Exo III對(duì)該雙鏈進(jìn)行識(shí)別和切割，釋放出microRNA 21繼續(xù)與完整的探針雜交開始下一個(gè)循環(huán)。即一個(gè)microRNA會(huì)引起多個(gè)循環(huán)并釋放出許多疏水的TPEPy，聚集在一起產(chǎn)生黃色熒光，檢測(cè)限為1 pmol/L。將FAM/Cy3及其相應(yīng)的淬滅基團(tuán)作為對(duì)照，同樣可以進(jìn)行microRNAs的檢測(cè)，但是由于熒光漂白現(xiàn)象，這種方法并不適合長期的細(xì)胞示蹤。

2.2 Exo III介導(dǎo)的DNA功能核酸生物傳感器的研究進(jìn)展

Cai等［28］利用兩個(gè)3′端凸出的P1、P2分子信標(biāo)進(jìn)行Exo III介導(dǎo)的雙重循環(huán)放大反應(yīng)來檢測(cè)人血色素沉著癥基因（T）（圖3-A）。由于這兩個(gè)分子信標(biāo)P1和P2為3′端凸出，可抵抗Exo III的消化，因此可在Exo III條件下穩(wěn)定存在，背景信號(hào)低。T存在時(shí)，先與P1雜交形成雙鏈，由于TP1雙鏈中P1為平末端，因此其3′端被Exo III部分消化，釋放出T和X。由于Exo III對(duì)單鏈T有很弱的消化活性，因此這一步的放大反應(yīng)會(huì)一直持續(xù)到所有的T被緩慢降解完，此時(shí)已經(jīng)積累大量的X。X的設(shè)計(jì)比較特殊，可以抵抗住Exo III的消化。P2兩端修飾了熒光和淬滅基團(tuán)，由于P2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，處于熒光淬滅狀態(tài)。當(dāng)與X雜交時(shí)，發(fā)夾打開，熒光增強(qiáng)，雙鏈中的P2產(chǎn)生了3′凹端，被Exo III消化，而X可以循環(huán)消化P2，導(dǎo)致很強(qiáng)的放大反應(yīng)。根據(jù)DNA濃度與熒光信號(hào)的關(guān)系，可對(duì)T進(jìn)行定量檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá)0.3 pmol/L DNA。Zuo等［29］也利用5′端修飾熒光基團(tuán)，分子內(nèi)部修飾淬滅基團(tuán)的分子信標(biāo)對(duì)DNA進(jìn)行了檢測(cè)。

圖2 利用Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略檢測(cè)microRNAs

Huang等［30］將Exo III介導(dǎo)的靶物質(zhì)循環(huán)和鳥嘌呤納米線的信號(hào)放大方法進(jìn)行巧妙結(jié)合，對(duì)人體免疫缺損病毒（即艾滋病毒HIV）基因進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)（圖3-B）。當(dāng)靶DNA存在的時(shí)候，會(huì)與HP1雜交生成平末端，引發(fā)Exo III的消化，釋放出靶基因進(jìn)入Exo III介導(dǎo)的消化循環(huán)。每個(gè)消化循環(huán)都會(huì)得到一個(gè)help DNA產(chǎn)物，該產(chǎn)物與HP2雜交能夠?qū)P2的富G區(qū)域c-myc釋放，在K+存在情況下形成平行的G-四鏈體（G4）結(jié)構(gòu)。由于Mg2+能夠識(shí)別和促發(fā)G4序列沉淀并且形成高聚物結(jié)構(gòu)［31］，因此最后一步加入c-myc和Mg2+孵育可產(chǎn)生鳥嘌呤納米線，與氯高鐵血紅素（Hemin）形成復(fù)合物，催化H2O2氧化四甲基聯(lián)苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine，TMB），可觀察到電化學(xué)信號(hào)的增強(qiáng)，檢測(cè)限為3.6 pmol/L。Chen等［32］也報(bào)道了一種利用Exo III檢測(cè)HIV基因的生物傳感器（圖3-C）。首先將DNA探針的3′端修飾了羧基四甲基羅丹明（Carboxytetramethyl rhodamine，TAMRA），與此同時(shí)為了與上轉(zhuǎn)換納米顆粒（Upconversion nanoparticles，UCNPs）表面的羧基可以共價(jià)結(jié)合，在其5′端修飾了氨基。當(dāng)靶DNA與標(biāo)記了TAMRA的DNA探針雜交時(shí)，Exo III識(shí)別并降解dsDNA，釋放出靶DNA繼續(xù)該循環(huán)，同時(shí)釋放出游離TAMRA。事實(shí)上，UCNPs只有與完整的含TAMRA標(biāo)簽的DNA探針共價(jià)結(jié)合，才會(huì)發(fā)生從UCNPs到TAMRA的能量共振轉(zhuǎn)移，由此對(duì)HIV基因進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為15 pmol/L。Luo等［33］還利用Exo III介導(dǎo)的循環(huán)放大優(yōu)勢(shì)對(duì)編碼腸桿菌β-半乳糖苷酶的Lac Z基因進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限為8.7 fmol/L。

2.3 Exo III介導(dǎo)的金屬離子功能核酸生物傳感器

Zhang等［34］采用 Fe3+/ZnO-Ag光催化劑結(jié)合Exo III建立了一種靈敏的光電化學(xué)傳感器來檢測(cè)Hg2+的濃度（圖4-A）。Fe3+/ZnO-Ag在可見光照射下能夠提供光電流。加入Hg2+后，根據(jù)T-Hg2+-T的原理可以使發(fā)夾DNA形成平末端供Exo III發(fā)揮切割功能，切割后釋放的Hg2+重新與3′凸起端的發(fā)夾結(jié)合進(jìn)入循環(huán)；而切割后產(chǎn)物暴露出的G4序列與hemin組成復(fù)合物hemin/G4作為DNAzyme發(fā)揮活性，使4-氯-1-萘酚（4-CN）被氧化為不溶物苯基-4-氯己二烯并沉積在電極表面，阻隔界面電子傳遞過程從而影響系統(tǒng)光電流。基于此生物催化沉積法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的光電化學(xué)法檢測(cè)，線性范圍是0.5-100 nmol/L，檢測(cè)限是 0.1 nmol/L。Gan等［35］也根據(jù)T-Hg2+-T與Exo III介導(dǎo)的循環(huán)信號(hào)放大組合設(shè)計(jì)了一個(gè)電化學(xué)傳感器，最后利用［Ru（NH3）6］3+與DNA骨架的靜電作用力特異性檢測(cè)Hg2+的濃度，檢測(cè)限低至1 pmol/L。

圖3 利用Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略檢測(cè)DNAs

圖4 利用Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略檢測(cè)金屬離子

Hong等［36］采用Exo III和金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs），設(shè)計(jì)了一種基于DNA構(gòu)象變化的比色傳感器（圖4-B）。無Hg2+時(shí)，發(fā)夾DNA（H-DNA）結(jié)合到AuNPs上，使其能夠在高離子濃度的溶液中穩(wěn)定存在。Hg2+存在時(shí)，由于T-Hg2+-T的原理，H-DNA的凸出端會(huì)完全形成3′平末端，Exo III則開始從H-DNA的3′端逐步移除單核苷酸，于是Hg2+被釋放繼續(xù)進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。H-DNA被降解后可形成穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)，此時(shí)AuNPs在高離子濃度的環(huán)境中發(fā)生聚集，導(dǎo)致顏色由紅變藍(lán)。該方法的線性檢測(cè)范圍為10 pmol/L-100 nmol/L，檢測(cè)限低至3.2 pmol/L。

2.4 Exo III介導(dǎo)的蛋白質(zhì)功能核酸生物傳感器

凝血酶不僅是止血和凝血過程中很重要的絲氨酸蛋白酶，而且還是一種指示腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物［37-38］。Yang等［39］利用凝血酶的適配體發(fā)明了一種“DNA多重開關(guān)”的電化學(xué)傳感器以檢測(cè)凝血酶（圖5-A）。第一步，先將雙鏈 S1/S2 組裝到金電極表面，之后S1的部分序列會(huì)與凝血酶的適配體（TBA）雜交產(chǎn)生新的dsDNA（S1/S2-TBA）。該dsDNA具有3′凸起端，能夠抵抗Exo III的消化。作為電化學(xué)發(fā)光指示劑，Ru（phen）32+能有效插入到雙鏈中產(chǎn)生強(qiáng)烈的電化學(xué)信號(hào)。第二步，加入凝血酶后，與TBA結(jié)合形成TBA-凝血酶的復(fù)合物，釋放TBA，導(dǎo)致電極表面固定的雙鏈由3′端凸起變成凹陷，產(chǎn)生了Exo III的切割位點(diǎn)，之后Exo III消化了S2的紅色部分序列，因此藍(lán)色序列S2*得到釋放。由于釋放的S2*與TBA存在部分互補(bǔ)，因此S2*與TBA進(jìn)一步雜交，使S1/S2-TBA由3′端凸起變成S1/S2/S2*-TBA平末端，Exo III又能發(fā)揮降解作用，降解TBA和S2的紅色序列，導(dǎo)致更多S2*的釋放。釋放的S2*再次與TBA雜交，不斷啟動(dòng)dsDNA的循環(huán)降解，這將大大減少Ru（phen）2+3的插入，抑制電化學(xué)發(fā)光效應(yīng)。這種由Exo III介導(dǎo)的dsDNA循環(huán)對(duì)凝血酶的檢測(cè)具有很高靈敏度，檢測(cè)范圍是0.1-200 pmol/L，檢測(cè)限是45 fmol/L。Zhao等［40］也將Exo III的信號(hào)放大原理運(yùn)用到檢測(cè)凝血酶的生物傳感器中。凝血酶存在時(shí)，兩個(gè)TBA亞基能自組裝成完整的適配體以識(shí)別和結(jié)合凝血酶，由此使相連的短雙鏈區(qū)域穩(wěn)定存在，Exo III發(fā)揮降解作用，然后借助T4連接酶和銅納米顆粒的性質(zhì)實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)，使傳感器表現(xiàn)出較高的靈敏性，檢測(cè)范圍是100 fmol/L-1 nmol/L，檢測(cè)限為20.3 fmol/L。

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）是一種與肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌相關(guān)的廣譜腫瘤生物標(biāo)志物［41］。由于在患病早期，生物標(biāo)志物的濃度比較低，因此需要可靠的、靈敏度較高的方法對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)［42］。He等［43］首次將 Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略與“DNA walker”納米機(jī)器巧妙結(jié)合，開發(fā)出一種檢測(cè)癌胚抗原的生物傳感器（圖5-B）。H1和H2是可通過自身雜交成莖環(huán)的序列，癌胚抗原存在時(shí)，會(huì)與H1中的適配體部分結(jié)合導(dǎo)致H1的構(gòu)象變化，從莖環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镃EA@H1復(fù)合體結(jié)構(gòu)，暴露出的a、b區(qū)域，于是與H2的3′凸出端開始雜交，形成平末端，使Exo III從H2的3′端開始降解，釋放出CEA@H1和walker DNA。CEA@H1將與新的H2結(jié)合參與新的循環(huán)，而walker DNA則通過與硅微球表面修飾的H3-e*發(fā)生作用形成H3@walker DNA，從而暴露i，因此i可與H4的i*雜交引發(fā)鏈置換反應(yīng)最終形成H3@H4@walker DNA三重復(fù)合體。由于H3@H4復(fù)合體傾向于形成熱力學(xué)上最有利的構(gòu)象，因此walker DNA會(huì)被釋放參與下一個(gè)反應(yīng)循環(huán)。H3@H4復(fù)合體中，k會(huì)形成G4結(jié)構(gòu)，與NMM染料結(jié)合發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。該傳感器具有很高的靶標(biāo)特異性，并實(shí)現(xiàn)了1.2 pg/mL的低檢測(cè)限，線性范圍是10 pg/mL-100 ng/mL。

Lu等［44］先將轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50的信號(hào)轉(zhuǎn)換成ssDNA信號(hào)，再利用Exo III對(duì)該ssDNA進(jìn)行循環(huán)信號(hào)放大，對(duì)NF-κB p50進(jìn)行檢測(cè)（圖5-C）。首先，ON1和ON2雜交形成dsDNA，且包括了一段NF-κB p50識(shí)別位點(diǎn)。不存在NF-κB p50時(shí)，由于dsDNA為平末端因此會(huì)被Exo III完全降解，無法產(chǎn)生后續(xù)反應(yīng)。存在NF-κB p50時(shí)，它會(huì)結(jié)合到dsDNA上，保護(hù)ON2的3′端抵抗Exo III的降解，而由于ON1的3′端沒有保護(hù)，因此被降解，從而釋放出ON3。以上屬于NF-κB p50到ssDNA的信號(hào)轉(zhuǎn)換部分。修飾亞甲藍(lán)的ON4能夠與ON3雜交，并在Exo III的作用下開啟循環(huán)反應(yīng)。NF-κB p50的檢測(cè)范圍是10-5 000 pmol/L，檢測(cè)限是 10 pmol/L。Li等［45］還使用了銀納米簇分子信標(biāo)（AgMBs）的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了熒光開關(guān)，同時(shí)利用Exo III的切割和信號(hào)循環(huán)性質(zhì)，對(duì)多種轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行定量分析。除了用Exo III檢測(cè)凝血酶、抗原和轉(zhuǎn)錄因子外，Yang和Gao［46］還將AuNPs的聚沉性質(zhì)與Exo III聯(lián)合使用，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)葉酸受體的可視生物傳感器。

2.5 Exo III介導(dǎo)的酶活檢測(cè)功能核酸生物傳感器

Xue等［47］將DNA固定在磁珠上，協(xié)同Exo III的循環(huán)指數(shù)放大效應(yīng)，建立了一種檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA adenine methyltransferase，DAM）活性的熒光磁性生物傳感器（圖6-A）。首先將含有G4序列的單鏈（綠色）與分子信標(biāo)雜交成dsDNA，組裝在磁珠上（圖6-Aa）。其次，由于發(fā)夾探針具有GATC識(shí)別位點(diǎn)，因此根據(jù)DAM和Dpn I內(nèi)切酶的性質(zhì)，聯(lián)合使用對(duì)發(fā)夾探針進(jìn)行先甲基化再切割，釋放出TSP單鏈（圖6-Ab），雜交到磁珠上的dsDNA，形成平末端，此時(shí)Exo III從3′端開始降解，釋放出TSP和新TSP，TSP繼續(xù)循環(huán)I反應(yīng)，新TSP進(jìn)入循環(huán)II（圖6-Ac）。這兩種循環(huán)的原理類似，且每輪循環(huán)后的降解產(chǎn)物即磁珠上殘留的G4序列（綠色），會(huì)與ZnPPIX形成ZnPPIX/G4復(fù)合物，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，從而對(duì)DAM的酶活進(jìn)行定量檢測(cè)，最低檢測(cè)限為 2.0×10-4U/mL。Li等［48］和 Liu 等［49］也同樣利用了DAM和Dpn I的性質(zhì)，結(jié)合電化學(xué)或2-氨基嘌呤的熒光特性對(duì)DAM的活性進(jìn)行了測(cè)定。

圖5 利用Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略檢測(cè)蛋白質(zhì)

端粒酶是一種能夠?qū)ⅲ═TAGGG）n串聯(lián)重復(fù)序列添加到染色體末端維持端粒長度的核糖核蛋白［50］。大多數(shù)正常的細(xì)胞中，端粒酶活性處于抑制狀態(tài)，但人類85%癌癥細(xì)胞中，端粒酶活性出現(xiàn)上調(diào)或者再激活，因此端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)于癌癥診斷，篩選抗癌藥物或者癌癥治療的評(píng)估具有十分重要的意義［51-54］。Min等［55］通過點(diǎn)擊反應(yīng)將疏水的TPE-Py與親水的線性DNA序列連接形成TPE-Py-DNA，作為熒光報(bào)告基因（圖6-B）。端粒酶存在時(shí)，能夠?qū)⒅貜?fù)單元（TTAGGG）n添加到TS primer末端，此延長產(chǎn)物會(huì)與TPE-Py-DNA雜交形成dsDNA，隨后被Exo III消化釋放出延長產(chǎn)物和TPE-Py。釋放后的產(chǎn)物會(huì)繼續(xù)與新的TPE-Py-DNA雜交開始下一個(gè)循環(huán)，而疏水的TPE-Py將聚集在一起產(chǎn)生與端粒酶活性相關(guān)的熒光信號(hào)。該方法不僅可以對(duì)不同的細(xì)胞系進(jìn)行胞內(nèi)端粒酶的活性檢查，而且能根據(jù)尿液樣品將癌癥病人與正常人區(qū)準(zhǔn)確地區(qū)分開，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。除了DAM和端粒酶，還可將Exo III用于T4多聚核苷酸激酶［56-57］和糖苷酶［58］等活性的檢測(cè)。

圖6 利用Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略檢測(cè)酶活

2.6 Exo III介導(dǎo)的其他靶物質(zhì)功能核酸生物傳感器

2012年，Niu等［59］利用一條標(biāo)記有熒光基團(tuán)的DNA單鏈發(fā)夾探針，通過Exo III介導(dǎo)的信號(hào)循環(huán)放大反應(yīng)對(duì)可卡因進(jìn)行了簡(jiǎn)單高效的定量檢測(cè)。2013年及 2016年，Zhu等［9］和 Zhao等［60］根據(jù)ATP依賴的T4連接酶的酶活性質(zhì)，以及Exo III對(duì)底物的切割特性，設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)ATP濃度的簡(jiǎn)單、靈敏的生物傳感器，檢測(cè)限分別為0.2 nmol/L和 20 pmol/L。2016 年，Ramezani等［61］將 AuNPs淬滅熒光的特性，結(jié)合卡那霉素的適配體及其互補(bǔ)鏈，設(shè)計(jì)了一種Exo III介導(dǎo)的信號(hào)循環(huán)放大生物傳感器，可對(duì)血清和牛奶中的卡那霉素含量進(jìn)行檢測(cè)。Fu等［62］通過3條DNA中的脫堿基位點(diǎn)可特異性識(shí)別三聚氰胺的原理，設(shè)計(jì)了一個(gè)由Exo III介導(dǎo)的三聚氰胺生物傳感器，線性范圍是1 nmol/L-0.5 μmol/L，檢測(cè)限是0.43 nmol/L。Sun等［63］將正電荷的磁珠與ssDNA通過非共價(jià)靜電吸引作用連接在一起，由于致病菌帶有大量負(fù)電荷表面，因此與磁珠會(huì)發(fā)生相互作用，DNA則被取代釋放到溶液中參與Exo III介導(dǎo)的DNA信號(hào)放大過程，從而對(duì)致病菌實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的目的。

3 Exo III與其他信號(hào)放大策略相結(jié)合的生物傳感器

為了提高生物傳感器的靈敏性，信號(hào)放大技術(shù)被廣泛運(yùn)用到傳感器的設(shè)計(jì)當(dāng)中，從而提高輸出信號(hào)的強(qiáng)度。PCR是最普遍的DNA擴(kuò)增技術(shù)之一，可是PCR有一些限制因素，如需要熱循環(huán)和高溫變性［64］。而RCA和HCR屬于等溫技術(shù)，不需要熱循環(huán)，能夠在更廣闊的領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。將Exo III與RCA或者HCR相結(jié)合的雙重信號(hào)放大策略，比單純的一重信號(hào)放大具有更強(qiáng)的信號(hào)輸出和更高的靈敏性，甚至可以將檢測(cè)限降低至amol/L級(jí)。

3.1 Exo III與RCA相結(jié)合的生物傳感器

RCA是一種利用擴(kuò)增酶（如phi29、Bst、Klenow等）進(jìn)行高效等溫?cái)U(kuò)增的過程［65］。在RCA過程中，聚合酶將單核苷酸持續(xù)地添加到與環(huán)形模板退火雜交后的引物上，產(chǎn)生具有重復(fù)序列的長單鏈，甚至能夠使靶物質(zhì)的檢測(cè)達(dá)到一個(gè)單分子的水平，并且在溶液［7］、固相載體［66］或者復(fù)雜的生理環(huán)境中［67］（如細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)）均可進(jìn)行。

Zhou等［68］將Exo III介導(dǎo)的靶標(biāo)循環(huán)體系與RCA技術(shù)合二為一，設(shè)計(jì)出一種具有超高靈敏性的電化學(xué)生物傳感器，用來檢測(cè)tDNA（即一種與阿爾茨海默病相關(guān)的生物標(biāo)志物）（圖7-A）。先將hDNA通過Au-SH鍵修飾在電極表面，當(dāng)tDNA與hDNA雜交后，Exo III通過切割hDNA，釋放出tDNA與更多的hDNA雜交、切割及釋放，形成一個(gè)往復(fù)循環(huán)。同時(shí)，hDNA被切割后的剩余片段能夠促發(fā)RCA，產(chǎn)生大量富G4序列的長鏈，與hemin形成的hemin/G4復(fù)合物具有擬過氧化物酶活性并產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。這種雙重信號(hào)放大的方法具有很高的靈敏性，檢測(cè)限為3.3 amol/L。

雙酚A是用于合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂的單體，在人體內(nèi)具有雌激素的活性［69］。聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂的應(yīng)用十分廣泛，可被用作奶瓶、杯子和醫(yī)療器械等的原材料。暴露在雙酚A的環(huán)境中，可能引發(fā)各種疾病包括心血管疾病、癌癥、出生缺陷或者生殖障礙等，即使非常低的含量也會(huì)對(duì)人體造成危害［70］，因此對(duì)雙酚A的定量檢測(cè)方法要求具備較高的靈敏性和選擇性。Li等［71］利用抗雙酚A的適配體設(shè)計(jì)了一種RCA/Exo III級(jí)聯(lián)放大生物傳感器（圖7-B）。首先，抗雙酚A的適配體（深藍(lán)色，用于識(shí)別雙酚A）與觸發(fā)序列（綠色，用于促發(fā)RCA）形成雙鏈DNA。雙酚A存在時(shí)，抗雙酚A的適配體會(huì)打開構(gòu)象與雙酚A結(jié)合，同時(shí)釋放出觸發(fā)序列，引發(fā)RCA反應(yīng)，作為初級(jí)信號(hào)放大。此時(shí)，RCA產(chǎn)物在發(fā)夾的輔助下促發(fā)Exo III介導(dǎo)二級(jí)信號(hào)放大，累積豐富的燈籠式G4結(jié)構(gòu)與ZnPPIX結(jié)合，產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，呈現(xiàn)出極高的靈敏度，檢測(cè)限為5.4×10-17mol/L。此外，基于Exo III-RCA的信號(hào)放大優(yōu)勢(shì)，Xue等［72］對(duì)DNA進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)限為0.51amol；Liu 等［73］對(duì)核酸酶 S1（檢測(cè)限為 5×10-7U/μL）和ATP（檢測(cè)限為5×10-4μmol/L）進(jìn)行了檢測(cè)。

圖7 RCA-Exo III聯(lián)用的生物傳感器

3.2 Exo III與HCR相結(jié)合的生物傳感器

2004年，Dirks和Pierce首次提出 HCR的概念［74］，這是一種無酶的體外核酸等溫信號(hào)放大技術(shù)。該技術(shù)需要兩條可雜交互補(bǔ)且含有黏性末端的發(fā)夾探針，以及引發(fā)探針。兩條發(fā)夾探針可以穩(wěn)定存在于溶液中，一旦加入引發(fā)探針，就會(huì)觸發(fā)HCR反應(yīng)的開始，使兩條發(fā)夾探針相繼打開，形成具有多個(gè)重復(fù)單元的長鏈dsDNA，直到原料耗盡。與其他核酸擴(kuò)增方法相比，HCR最大的優(yōu)勢(shì)在于無酶參與，為生物傳感器的研究工作提供了很大便利。

Sun等［75］利用HCR、Exo III結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼 光 譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）的方法設(shè)計(jì)了一個(gè)雙重信號(hào)放大的生物傳感器用于心肌梗塞基因的檢測(cè)（圖8-A）。靶基因存在時(shí)，會(huì)打開發(fā)夾probe 1互補(bǔ)雜交成dsDNA，Exo III從probe 1的3′平末端開始切割，釋放出靶基因進(jìn)入下個(gè)循環(huán)，同時(shí)剩余的切割產(chǎn)物作為促發(fā)子打開Hp1繼而啟動(dòng)HCR反應(yīng)，生成線性長dsDNA。由于Hp1和Hp2末端帶有Tamra標(biāo)簽，因此可以呈現(xiàn)出具有特征性的SERS指紋信號(hào)。此方法實(shí)現(xiàn)了1 fmol/L-10 nmol/L的線性關(guān)系，檢測(cè)限為1 fmol/L。

Yu等［76］不僅利用Exo III和HCR進(jìn)行雙重信號(hào)放大，而且還利用了石墨烯和熒光嵌入劑SYBR GREEN I，建立了一種檢測(cè)Hg2+熒光生物傳感器（圖8-B）。首先利用T-Hg2+-T的原理使HP DNA和assisted DNA之間通過鏈置換反應(yīng)形成dsDNA，隨后Exo III從其3′端平末端開始降解導(dǎo)致Hg2+和assisted DNA循環(huán)利用，同時(shí)釋放出DNA觸發(fā)鏈（Trigger strand），開始HCR形成長鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)。SYBR GREEN I可以嵌入剛性dsDNA中發(fā)出較強(qiáng)的熒光，而不被石墨烯吸附。通過條件優(yōu)化，該傳感器對(duì)Hg2+的最低檢測(cè)限為7.37 pmol/L，線性范圍是0-1.5 nmol/L，并且對(duì)Hg2+具有較高的選擇性。Bao等［77］和Xiong等［78］也將Exo III和HCR聯(lián)用設(shè)計(jì)了能夠檢測(cè)Hg2+的電化學(xué)傳感器。Sun等［79］利用Exo III介導(dǎo)的DNA循環(huán)和HCR檢測(cè)了腺苷含量。

圖8 HCR-Exo III聯(lián)用的生物傳感器

4 Exo III與納米材料相結(jié)合的生物傳感器

納米材料指的是由無機(jī)或有機(jī)材料制備合成，并且在三維空間中至少有一維在100 nm以下的功能材料，由于粒子尺寸非常小，納米材料產(chǎn)生了不同于傳統(tǒng)材料的一些物理、化學(xué)特性，如量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)等［80］。如今各種新型的納米材料得到了大力發(fā)展和應(yīng)用，包括AuNPs、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、碳納米管、石墨烯和氧化石墨烯、金屬納米簇、碳點(diǎn)和上轉(zhuǎn)換納米顆粒等，這些納米材料都可以與適當(dāng)?shù)姆治龇椒▽W(xué)和檢測(cè)技術(shù)搭載，設(shè)計(jì)成多樣化的生物傳感器以檢測(cè)生物樣本或者環(huán)境污染中的相關(guān)靶物質(zhì)［81］。

AuNPs不僅穩(wěn)定性高，具有獨(dú)特的光學(xué)、熱學(xué)和較好的生物相容性質(zhì)，還可與熒光基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移成為極強(qiáng)的熒光淬滅劑［82］。Zhao等［83］利用赭曲霉毒素A的適配體，采用Exo III的信號(hào)放大手段結(jié)合AuNPs的熒光淬滅原理對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)限低至4.82 nmol/L。AuNPs不僅能夠產(chǎn)生顏色和熒光淬滅效應(yīng)促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還能夠通過加載大量信號(hào)標(biāo)簽使信號(hào)識(shí)別產(chǎn)生放大效應(yīng)，從而提高生物傳感器的靈敏度和特異性。例如，Huang等［84］設(shè)計(jì)了一種多重標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器，將3種含有不同Redox標(biāo)簽的信號(hào)探針修飾在AuNPs上作為生物條形碼放大策略，與Exo III介導(dǎo)的酶催化反應(yīng)組成了雙重信號(hào)放大系統(tǒng)檢測(cè)，可以同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因樣本中的3種DNA組分進(jìn)行檢測(cè)。

量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）是一種很有前景的熒光納米顆粒，與其他有機(jī)染料和熒光蛋白相比，具有熒光強(qiáng)度大、光穩(wěn)定性高和波長可調(diào)的優(yōu)點(diǎn)［85］。Jie等［85］利用磁珠@Au復(fù)合材料的磁性分離特性以及Exo III介導(dǎo)的靶標(biāo)循環(huán)放大策略，使用兩種可區(qū)分的CdSe/ZnS和CdTe QDs熒光探針，對(duì)miRNA-141和miRNA-21進(jìn)行了同步熒光檢測(cè)，檢測(cè)范圍在5 pmol/L-50 nmol/L之間，檢測(cè)限是1.5 pmol/L。同年，Jie等［86］在Au-氧化石墨烯納米復(fù)合材料修飾電極上逐級(jí)組裝CdSe-NH2和CdSe-COOH QDs層，根據(jù)雙層QDs與Au@Ag之間的電化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)變化的原理，結(jié)合Exo III信號(hào)循環(huán)放大體系設(shè)計(jì)了一個(gè)檢測(cè)凝血酶的生物傳感器。Zhang等［87］通過一步法合成DNA-ZnS：Mn2+量子點(diǎn)，建立了一種以QDs和WS2納米片之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移為研究基礎(chǔ)的生物傳感器，用于檢測(cè)鏈霉親和素。

Wang等［88］將金納米簇/石墨烯（AuNCs/GR）納米雜化物標(biāo)記上SH-DNA和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）形成AuNCs/GR-DNA-ALP復(fù)合物，作為催化界面。靶DNA引發(fā)Exo III循環(huán)后產(chǎn)生的切割產(chǎn)物，與金電極上的抓捕探針和AuNCs/GRDNA-ALP中的SH-DNA均部分互補(bǔ)雜交，從而使AuNCs/GR-DNA-ALP固定在電極表面，最終AuNCs/GR-DNA-ALP催化銀沉積反應(yīng)生成銀納米顆粒產(chǎn)生可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。此外，除了本節(jié)提到的金納米顆粒、量子點(diǎn)、石墨烯及金納米簇，還有前面提到的銀納米簇分子信標(biāo)、上轉(zhuǎn)換納米顆粒等均可與Exo III的信號(hào)放大策略相結(jié)合，大大提高傳感器的靈敏度和特異性。

5 總結(jié)和展望

綜上，Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略已被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的檢測(cè)領(lǐng)域，其最顯著的優(yōu)勢(shì)在于Exo III酶切速度快，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成信號(hào)放大過程；其次，常溫即可反應(yīng)，活性不易丟失，不需熱啟動(dòng)步驟；可與各種常見的信號(hào)輸出方式（如熒光法、比色法和電化學(xué)法等）或其他信號(hào)放大方式（RCA或HCR）相結(jié)合，以及能夠借助磁珠或者AuNPs等新興納米材料提高檢測(cè)效果，具有較好的兼容性。另外，還能夠?qū)⒉煌N類的靶物質(zhì)均轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)，再進(jìn)行Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大，即不受靶物質(zhì)種類的約束，這些特點(diǎn)充分滿足了生物傳感器快速、簡(jiǎn)便的要求。需要注意的是，Exo III是一種具有多種活性的核酸酶，在使用過程中需要考慮該酶的切割性質(zhì)，同時(shí)溶液中金屬離子的作用可能會(huì)影響酶活，盡量避免錯(cuò)誤切割、酶活受抑制等問題的出現(xiàn)。

目前Exo III介導(dǎo)的生物傳感器主要應(yīng)用于DNA、蛋白質(zhì)及小分子物質(zhì)的檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用方面，偏向于與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物檢測(cè)，以及環(huán)境中重金屬的檢測(cè)等。未來Exo III介導(dǎo)的信號(hào)放大策略在生化分析的發(fā)展趨勢(shì)可能包括以下幾方面：（1）簡(jiǎn)便生物傳感器的大量應(yīng)用：傳感器的設(shè)計(jì)可繁可簡(jiǎn)，最終目的是實(shí)際應(yīng)用，爭(zhēng)取用更短的時(shí)間更低的成本實(shí)現(xiàn)利益最大化。與復(fù)雜的傳感器相比，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的傳感器不僅節(jié)約成本，而且完全可以通過Exo III介導(dǎo)一重或雙重信號(hào)放大的方式達(dá)到較低的檢測(cè)限，為開拓應(yīng)用市場(chǎng)提供了有利的條件保障。（2）納米材料的多樣化搭載：隨著新型納米材料的不斷更新和應(yīng)用，使生物傳感器在靈敏度和分析方法的應(yīng)用方面有很大提升。然而與Exo III搭載的新型納米材料主要集中在石墨烯、金納米顆粒和量子點(diǎn)等，在其他類型納米材料如水凝膠等的應(yīng)用還有很大空間。（3）胞內(nèi)檢測(cè)：目前由Exo III介導(dǎo)的信號(hào)循環(huán)放大檢測(cè)主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)胞內(nèi)的檢測(cè)雖有文獻(xiàn)報(bào)道，但這方面的應(yīng)用較少，對(duì)于臨床診斷來說，胞內(nèi)檢測(cè)和胞內(nèi)成像無疑將成為未來的研究重點(diǎn)。（4）多重檢測(cè)：Exo III價(jià)格合理、應(yīng)用簡(jiǎn)便，可通過核酸鏈的精心設(shè)計(jì)或者多酶聯(lián)用，進(jìn)行多靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，因此由Exo III介導(dǎo)的多功能生物傳感器或?qū)⒊蔀槲磥淼陌l(fā)展方向。（5）不同金屬離子的檢測(cè)：目前關(guān)于Exo III檢測(cè)金屬離子的文獻(xiàn)基本局限于利用T-Hg2+-T的原理來檢測(cè)Hg2+，因此對(duì)其他金屬離子的檢測(cè)還需進(jìn)一步探索和研究。（6）在病毒、細(xì)菌感染以及肉品摻假等實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑷〉酶噙M(jìn)展。由此可見，Exo III高效、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)充分滿足了生物傳感器的檢測(cè)需求，具有十分可觀的應(yīng)用前景。