關于雙鏈特異性核酸酶介導的生物傳感器研究進展

肖星凝 朱龍佼 李相陽 羅云波 許文濤

（1. 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 農業(yè)部農業(yè)轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083；3. 北京農學院食品科學系，北京 102206）

2002 年，Shagin等［1］從蝦、蟹等十足目動物的消化腺或肝胰腺中分離得到一種DNA核酸酶，被稱為雙鏈特異性核酸酶（Duplex-specific nuclease，DSN）［2］。以往的實驗多利用DSN酶為介導等溫擴增檢測miRNA［3］或構建均一化全長 cDNA文庫［4］、 檢 測 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性（Single nucleotide polymorphism，SNP）［1］、測定端粒長度［5］等。目前，結合DSN酶對核酸鏈特有的性質及生物傳感器快速、微量檢測的優(yōu)點，人們設計出了許多精確度越來越高的DSN酶介導的核酸生物傳感器，可以用來檢測不同種類的RNA、重金屬［6］、蛋白質［7］等，使得DSN酶的運用越來越廣泛。本文對近年來運用DSN酶為介導的生物傳感器進行了分類，旨在使人們更多的了解DSN酶在生物傳感器中的作用，指導人們有效、合理地設計和使用DSN酶介導的核酸生物傳感器。

1 DSN酶的介紹

1.1 DSN酶的結構

Anisimova等［8］利用特定引物和cDNA末端快速 擴 增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術，在堪察加半島蟹的肝胰臟中克隆了DSN基因并測定了它完整的初級結構，還建立了一個有效的純化DSN酶的方法。DSN酶的初級結構與著名的沙雷氏菌中的非特異性核酸酶相類似，但與其性質不同，DSN酶能準確地切割（或水解）雙鏈DNA 或是DNA/RNA雜交鏈中的DNA鏈，同時能保證單鏈DNA /RNA、單鏈的完整性；沙雷氏菌中的非特異性核酸酶卻是水解RNA和單、雙鏈DNA。

1.2 DSN酶的性質

Anisimova等［8］、Qiu 等［2］對 DSN 酶的相關性質進行了總結。DSN酶蛋白是一種分子量為41.5 kD的單體，等電點為4.2。DSN酶活化需要加入鎂離子（至少5 mmol/L，最佳濃度為7 mmol/L），Ca2+并不能直接激活DSN酶，但能顯著增強Mn2+、Co2+和Mg2+對酶的激活能力，產生協同作用，同時，DSN酶活性隨離子濃度增加而降低。DSN酶是一個高度耐熱的酶，最適溫度60℃，在70℃下加熱30 min，DSN酶只會失去部分活性，即使是在100℃下加熱30 min，還會留有7%的活性［8］。有效pH值區(qū)間3-9，最佳pH值為6.6。EDTA能完全抑制酶活性，且DSN酶對多胺和離液劑比較敏感。DSN酶可以區(qū)分完全互補配對和不完全互補配對的雙鏈雜交物，能實現單堿基區(qū)分。底物長度要求：DNA雙鏈中最小 9 bp［8］或 10 bp［2］DNA，較短的 DNA 雙鏈不會被切割，保留完整，DNA/RNA雜交雙鏈的有效切割長度為 15 bp［2］。

1.3 DSN酶的切割產物

Liu等［9］在利用DSN酶對SNP進行無標記檢測的實驗中，闡述了當檢測樣品中的正常序列與探針完全互補配對時，可被DSN酶降解為dNMPs，dNMPs是含有一個磷酸的單核苷酸，驗證了DSN酶可能將底物雙鏈DNA水解成單個核苷酸，且沒有位點的切割，降解部位可能為磷酸二酯鍵。

Anisimova等［8］使用放射性同位素分別標記含有7、8、9 nt的單鏈DNA，再將這3條單鏈DNA分別與沒有標記的含43 nt的核苷核酸鏈雜交，用DSN酶去水解發(fā)現只有被標記的含9 nt的雙鏈DNA能被正常水解，且電泳圖顯示，水解產生較多的3、5 nt的核苷酸小片段。同時，Zhao等［5］利用DSN酶測量端粒長度，其原理主要是DSN酶能將雙鏈染色體切割成了小于10 bp的碎片，使單鏈的端粒保留完整，從而測量其長度。所以，由DSN酶切割所得的產物可能是由大部分短核苷酸鏈和小部分單核苷酸組成。Zhao等［5］還檢測了DSN酶切割剩余片段長度，設計了16 bp長的雙鏈DNA加18 nt長的單鏈，其中單鏈重復TTAGGG序列。經DSN酶水解后，除了發(fā)現了一個長為24 nt的核苷酸鏈，比實際設計的懸臂模板長了6 nt。說明了在雙鏈區(qū)域有5-6個核苷酸仍然未被降解，不管16 nt DNA片段是否含有75%或25%的GC含量，表明這個消化的限度是獨立的，不會進行特異性識別堿基對序列的切割。

2 DSN酶介導的檢測miRNA的光學傳感器

2.1 比色傳感器

比色法是通過觀察體系中溶液顏色的變化來判斷樣液中是否含有靶物質，其優(yōu)點是用肉眼即可看出顏色的變化，但不足之處是精確度不高，所以如需定量，可以使用核酸信號放大方法。

Wang等［10］利用A、B兩條探針去檢測miRNA，當90℃溫度下加熱5 min，達到解旋目的，如果有miRNA，則B探針會與之結合，加入的DSN酶會把B探針水解掉，只剩下A探針，這時A探針就會使金納米聚沉，從紅色變?yōu)樗{色，達到檢測目的；反之，如果沒有miRNA，A、B探針就會隨溫度下降再次結合，就不會使金納米變色，檢測限為20 pmol/L-1 nmol/L。Xia等［11］利用金納米特性設計了單探針檢測miRNA，然后最先提議的比色法轉變成了電化學法，達到了更低的檢測限，檢測范圍為0-25 fmol/L，最低檢測限為0.1 fmol/L。

2.2 熒光傳感器

熒光法檢測因為響應快速、靈敏度高、操作簡單，成為了一種較常用的檢測技術［12］，我們將以不同表達方式的物質分類的熒光傳感器進行介紹。

2.2.1 在納米網熒光傳感器中的應用 Guo等［13］設計了利用氧化石墨烯納米網可以淬滅熒光來檢測miRNA，帶有熒光基團的單鏈探針DNA與miRNA結合以后，就能被DSN酶降解，釋放出熒光基團而發(fā)出熒光；若沒有miRNA，探針DNA則不會被降解，就會被吸附到石墨烯上，熒光會被淬滅，最低檢測限是160 fmol/L。Xi等［14］首次利用WS2納米網來檢測miRNA，原理和Guo等［13］設計的一樣，不過是WS2納米網代替氧化石墨烯來淬滅單鏈探針DNA上的熒光基團，檢測限擴大到了300 fmol/L。

2.2.2 在磁性粒子熒光傳感器中的應用 Hao等［15］設計了一種雙重信號放大的檢測法檢測miRNA，如圖1。單鏈DNA探針分為藍色的miRNA識別探針和綠色的帶有熒光基團的轉換探針兩部分，首先，識別探針與miRNA完全互補配對后，DSN酶將識別探針切成碎片，進而熒光基團連同綠色轉換探針從磁珠上切離下來，游離到溶液中，同時靶標miRNA也釋放到溶液中與磁珠上新的捕獲探針進行結合，最終，一個miRNA可以釋放多個轉換探針，DSN酶切割完成后，利用磁場，將磁珠上未釋放的熒光基團從溶液中分離出來，溶液的熒光強度與被釋放的轉換探針數量有關，即與靶分子數量成正相關，可以通過熒光強度初步對靶標miRNA進行定量（圖1-A）。當分析物濃度過低，熒光強度無法準確識別時，本法又設計了電化學傳感進行二次信號放大（圖1-B），主要是通過轉換探針催化組裝固定在電極上的發(fā)卡探針進行取代反應，將熒光信號進一步轉化、擴增為電信號實現的。具體轉化擴增路徑如下：鎘納米粒子黏附在玻璃碳電極上，發(fā)卡H1連接在鎘納米粒子上，轉換部位的探針將與H1互補，使H1展開，露出H1的莖，另一個發(fā)夾H2與露出的H1莖互補配對，釋放出轉換部位的探針，再次達到循環(huán)目的。進行充足擴增以后，H1-H2復合體就能抓住連有多個G-四聯體/氯高鐵血紅素的具有DNA酶功能化的磁珠，導致電化學發(fā)光減少，這樣的H1-H2復合體數量取決于轉換部位的數量。

圖1 熒光檢測miRNA的原理示意圖［15］

Zhang等［16］設計了一種無標記的miRNA檢測方法，單鏈DNA探針通過鏈霉親和素和生物素連接在小磁珠上，探針分為兩部分，下部分可與miRNA結合，被DSN酶切割，然后釋放出的上部分探針單鏈DNA與Tb3+結合，使熒光強度增強。

Lv等［17］又設計了一種可以雙重信號擴增檢測miRNA的方法，其最低檢測限為7.3 fmol/L，miRNA來源于人體癌細胞，磁半球上連接的探針由兩部分組成，下部分為DNA，上部分為2-OMe-RNA，第一次信號擴增是由miRNA與下部分的DNA結合，DSN酶切碎DNA，釋放出miRNA和剩余的2-OMe-RNA部分，磁半球被磁鐵吸附，只剩2-OMe-RNA；第二次信號擴增，帶有熒光基團的Taqman探針可與2-OMe-RNA結合，再次被DSN酶切割，發(fā)出熒光，達到雙重檢測的目的。

2.2.3 在金納米粒子熒光傳感器中的應用 2016年，Xu等［18］設計了一種可以同時檢測多種miRNA的方法，將具有3D結構、不同顏色的熒光染料標記的四面體DNA探針固定在金納米粒子上，靶物質可以是miRNA-16、miRNA-21、miRNA-26a，與之對應的DNA探針結合，即可被DSN酶切碎，釋放出不同顏色的熒光物質，同時還能區(qū)別1個堿基、3個堿基錯配的情況。

2.3 化學發(fā)光傳感器

2016年，Wang等［19］發(fā)明一種化學發(fā)光傳感器，如圖2，使用聚多巴胺（PDA、能量受體）-納米半球為媒介，實現共振能量轉換，此法不需要有機染料或者任何標記。整個反應體系包括了檢測探針、聚多巴胺、氯高鐵血紅素、魯米諾、H2O2和DSN酶，該檢測探針由一個與miRNA堿基對互補的單鏈DNA和一個G-四聯體-氯高鐵血紅素DNA酶兩個部分組成，首先當有miRNA時，就會與DNA探針結合，DSN酶切碎探針后，釋放出的G-四聯體-氯高鐵血紅素就會和H2O2發(fā)生化學反應，使魯米諾發(fā)光，實現化學發(fā)光，但此時不發(fā)生能量共振傳遞；但沒有靶標存在下，G-四聯體不會剝離下來，加入過氧化氫、魯米諾發(fā)光，但同時，會和多巴胺納米球發(fā)生共振能量轉移，化學光被淬滅。檢測限范圍為80 pmol/L-50 nmol/L，最低檢測值為49.6 pmol/L。

圖2 化學發(fā)光傳感器的檢測miRNA原理圖

2.4 表面增強拉曼光譜傳感器

Pang等［20］將Cy3-DNA修飾到Fe3O4@Ag-磁納米粒子上，該磁納米粒子以Fe3O4為中心粒子，溶解于PEI活性劑溶液中，可吸附一層金，再從PVP活性劑和硝酸銀溶液中置換出銀，給磁納米粒子外面包裹上一層銀外殼，其形成過程如圖3。表面增強拉曼散射光，同時，DSN酶信號擴增。首先，miRNA被DNA探針捕獲，形成可被DSN酶切割的DNA-RNA雜交雙鏈。DSN酶切后，產生Cy3-DNA碎片，且不停地釋放miRNA，激發(fā)信號擴大循環(huán)。然后，用磁鐵濃縮溶液，Cy3-DNA碎片被清洗，即可讀出拉曼指數。基于Fe3O4@Ag-磁納米粒子的超順磁效應，miRNA let-7b無需PCR，可被DNA探針直接捕獲。最低檢測限為0.3 fmol/L，比傳統的熒光法檢測miRNA（- 100 fmol/L）低了3個數量級。

3 DSN酶介導檢測miRNA的電化學傳感器

熒光傳感器雖然簡便、易操作，但對環(huán)境要求較嚴格，相比之下，電化學傳感器的檢測靈敏度更高、且易于微型化和集成化，在未來具有很好的研究前景［21］。

圖3 Fe3O4@Ag-磁納米粒子的形成過程

3.1 金電極修飾傳感器

Zhang等［22］設計了一個光電化學傳感器，其分為連續(xù)的兩部分，上邊黑色部分是具有識別序列的單探針，硫醇在5′末端，下面藍色部分為2′-O-甲基修飾富含G堿基序列，通過硫-金共價物，連接在金電極上，miRNA將與黑色部分單探針結合，被DSN酶切碎后，釋放出的miRNA循環(huán)數次，直到金電極上僅剩2′-O-甲基修飾富含G堿基的序列可與加入氯高鐵血紅素結合形成2′-O-甲基修飾G-四聯體-氯高鐵血紅素，催化H2O2反應，與TMB發(fā)生變色，增強電流信號，該傳感器的檢測限為8 amol/L miR-21。2017年，Lu等［23］設計了一種雙重信號擴增檢測的方法，首先小磁珠上修飾著由兩部分組成的單鏈DNA探針，下面綠色部分可與需要檢測的靶物質結合，然后DSN酶切割，釋放出剩余上面藍色單鏈DNA部分，離心后，獲得上清液，藍色的單鏈DNA可與修飾在金電極上的單鏈DNA結合，此時再加入兩個發(fā)卡探針H1、H2，是H1、H2展開形成網狀與阿霉素磷酸鹽結合可形成量子點產生電化學發(fā)光信號。檢測let-7d的范圍為10 amol/L-10 nmol/L，最低檢測限為 10 amol/L。Liu等［24］也是利用DNA探針修飾在金納米上的原理設計了一種較復雜的電化學方法檢測miRNA，最低檢測限是0.2 fmol/L。

3.2 玻璃碳電極修飾傳感器

2016年，Zhang等［25］設計了一個利用鏈霉親和素-生物素結合，DSN酶介導的靶物質循環(huán)，富集捕獲探針，磁小珠吸附到玻璃碳電極上，產生相應電阻的傳感器。捕獲探針一端接有生物素，下面部分探針與miRNA雜交后，可以被DSN酶切碎，釋放出的生物素可與磁小珠上的鏈霉親和素結合，但因為生物素上的DNA探針太短，陰極帶電層不能形成，就會產生較小的電荷轉移電阻；當沒有miR-21時，探針將無法雜交，DSN酶不會水解單鏈DNA，因此，完整的探針可以吸附到玻璃碳電極表面，產生一個緊密的陰極電層，產生較大電子轉移電阻。上述的實驗方案達到了超靈敏檢測，miR-21檢測限為 60 amol/L。Hao 等［26］、Shuai等［27］也利用了玻璃碳電極修飾傳感器用來檢測miRNA，Hao等運用了DSN酶、金納米、魯米諾-金納米和半導體納米晶體等介導，能量發(fā)生共振轉移。Shuai等使用了結合鏈霉親和素堿性磷酸酶、DSN酶等介導。

3.3 ITO電極修飾傳感器

ITO電極就是銦錫氧化物玻璃電極。Fu等［28］設計了一個ITO電極修飾的傳感器檢測miR-10b，電擊上帶有負電荷，DNA探針一段帶有亞甲基藍，與miR-10b結合以后，可被DSN酶切碎，釋放出帶亞甲基藍的碎片可與電極之間發(fā)生電子轉移，產生電流電壓；反之，如果沒有靶物質的存在，亞甲基藍就無法與ITO電極傳遞電子。Li等［29］也使用了ITO電極及DSN酶，運用光電化學的原理來檢測miRNA。

4 DSN酶介導檢測miRNA的光磁傳感器

Tian等［30］利用光磁效應檢測兩種不同的miRNA，他們設計了一種組裝磁納米結構，內核是磁小珠，不同顏色的單鏈DNA探針連接在磁珠不同的層面，所以當miRNA與探針結合，被DSN酶切碎后，釋放出的磁性納米顆粒，光磁設備將會檢測車這些磁性納米顆粒的數量。光磁傳感器將記錄二次諧波，透射光密度及頻率。對于單定位點檢測let-7b，可觀察到檢測限在10 fmol/L - 10 nmol/L之間，實驗進行70 min時，最低檢測限可為4.8 fmol/L（圖 4）。

5 DSN酶介導檢測其他物質的生物傳感器

5.1 檢測重金屬Hg2+的應用

具有功能性的核酸生物傳感器在檢測重金屬領域中體現出越來越重要的地位，因為它們具有易操作、價格較便宜的特點。2017年，Ou等［7］就借助DSN酶介導設計了一種通過熒光檢測重金屬Hg2+的簡單的生物傳感器，核酸探針上只有熒光團，沒有淬滅基團，熒光基團后的序列可以對折互補，里面有T-T堿基錯配，DSN酶就不可以切割；當加入Hg2+后，Hg2+將兩個不互補的堿基連接在一起形成T-Hg2+-T結構，熒光峰值增加到137%；此時，再加入DSN酶，核酸鏈被切碎，釋放出熒光基團，熒光峰值增加到了1251%。這種實驗方法高效、簡單，可準確的檢測水樣中或生物細胞內的Hg2+濃度。

圖4 光磁傳感器檢測miRNA的工作原理

5.2 檢測蛋白質的應用

Yuan等［6］使用電化學的方法檢測家蠶微孢子全蛋白，首先在Au@Fe3O4粒子（即一層金附著在Fe3O4粒子上的結合物）上修飾A1單鏈DNA，Ab標記的探針S1與A1完美互補，根據鄰近效應，加入的靶物質家蠶微孢子全蛋白與S1、S2產生一種三明治結構，暴露出的A1單鏈DNA可與H1、H2、亞甲基藍發(fā)生雜交鏈式反應，再經過DSN酶切割以后，釋放出金屬離子、亞甲基藍、Ab，然后磁鐵吸附金屬離子，取上清液，得到的亞甲基藍溶液和電極之間發(fā)生電子傳遞，從而通過檢測電流達到檢測家蠶微孢子全蛋白的目的（圖5）。

圖5 檢測蛋白質的工作原理

5.3 檢測mRNA的應用

2015年，Li等［31］設計了一種雙信號擴增的方法檢測mRNA，整個設計由兩部分組成，探針S1連接在磁性納米顆粒5′端上，生物條碼連接在3′端，即S1上的末端連接金納米粒子，金納米上再連接修飾了CdS納米粒子的序列S2，形成了MNPs-S1-AuNPs-S2-CdS NP傳感體系，當靶物質mRNA與S1結合后，形成可被DSN酶切割的雙鏈，酶切以后，金納米粒子和由S2連接在一起的CdS納米粒子被釋放出來，當有超過100個CdS連接在金納米上時，實驗靈敏度就會大大增加。當納米粒子被HNO3溶解20 min后，然后用溶出伏安法測量。這種方法具有很靈敏的檢測能力，最低檢測限是0.48 fmol/L（圖 6）。

6 不同方法的檢測限對比

不同DSN酶介的生物傳感器主要是用來檢測miRNA，從表1中可以看出，使用電化學傳感器明顯比光學傳感器更加靈敏。在電化學傳感器中，金電極修飾和玻璃碳電極修飾的傳感器相對于其他的電化學傳感器能檢測到濃度更低的目標物質；在光學傳感器中，表面增強拉曼光譜傳感器的檢測限最低，表明它的靈敏度較高，但不如電化學傳感器。

7 結語

目前，DSN酶切割的具體方式還沒完全闡述清楚，而且，對DSN酶的一些性質也不太清楚，需要更多的研究，如DSN最大切割限度，將擴大DSN酶的應用范圍。同時，目前對新興的核酸或者人工核酸的作用探索較少，使用DSN酶介導的生物傳感器主要應用于檢測miRNA，通過采用不同檢測原理如比色法、熒光法、電化學法等，借助金納米粒子、小磁珠等物質來放大檢測信號，設計巧妙，但我們發(fā)現DSN酶仍可應用于檢測重金屬和蛋白質等物質中，而且這方面應用較少，所以這可能是未來的研究趨勢。

圖6 檢測mRNA的工作原理

表1 不同DSN酶介生物傳感器檢測方法的比較

常用的方法中，比色法雖然直觀，但精密度較低，可能只適用于miRNAs 的定性檢測，無法實現準確定量低濃度的miRNAs。而化學發(fā)光等這類檢測方法應該是比較新穎，可顯著提高檢測miRNAs的靈敏度和特異性。盡管電化學傳感器檢測方便、快速，但是其對檢測平臺的穩(wěn)定性要求較高，尤其是電極的加工工藝和探針的包被技術直接影響了電化學傳感器的應用前景［32］。同時檢測幾種物質成為最近設計生物傳感器的主要趨勢，為了檢測更低限度的物質，多重檢測信號擴增也是未來發(fā)展方向，而且，我們可以合理地利用金納米等其他有助于提高檢測限度的納米物質。