子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-373的表達(dá)變化及其臨床意義

譚飛非，徐紅， 李美儀， 何中慧

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530022)

微小核糖核酸即微小RNA(miRNA)，是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的、長度18～25 nt的單鏈非編碼內(nèi)源性小分子RNA，通過與靶基因3′-UTR區(qū)完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，是人類某些疾病(包括癌癥)發(fā)病的關(guān)鍵基因和調(diào)節(jié)因子[1]。miRNA表達(dá)譜分析表明，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其扮演著促癌或抑癌作用，如miR-21在乳腺癌中扮演抑癌基因[2]，而在結(jié)直腸癌中扮演促癌基因作用[3]。多種miRNA在子宮內(nèi)膜癌中的異常表達(dá)可以影響腫瘤的行為與進(jìn)展，如miR-944在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的侵襲[4]，miR-302c在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁正常組織中的miR-373，觀察其在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化，分析其表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并進(jìn)一步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年9月～2017年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受廣泛性子宮切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者30例(術(shù)前均未接受放化療)，手術(shù)治療時(shí)均留取癌組織，其中20例同時(shí)留取癌旁正常組織(癌旁2 cm以外)。留取的組織標(biāo)本均在離體后立即用液氮浸沒降溫，置-80 ℃冰箱凍存，所有標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。

1.2 試劑與儀器 TRIzol試劑(大連Takara公司)，RNase-free water(大連Takara公司)，miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司)，熒光定量PCR試劑盒(大連Takara公司)，RT-PCR、miRNA-373及U6引物(大連Takara公司)。NanoDrop2000紫外分光光度計(jì)，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 miR-373檢測方法 采用qRT-PCR。先用TRIzol試劑按其說明書提取受檢組織總RNA。用NanoDrop2000紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，OD260/OD280為1.8～2.1。逆轉(zhuǎn)錄cDNA，RT反應(yīng):10 μL反應(yīng)體系，37 ℃、1 h，85 ℃、5 min。qRT-PCR: 以U6作為內(nèi)參；U6上游引物序列為5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′、下游引物序列為5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′，miR-373上游引物序列為5′-TGCGCGAAGTGCTTCGATTTGG-3′、下游引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；以cDNA為模板，按試劑盒說明配置反應(yīng)液，上樣于ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-373相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

2 結(jié)果

子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁正常組織中miRNA-373的相對表達(dá)量分別為3.045±1.664、1.098±0.419，兩者相比，P<0.01。 miR-373在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與患者的腫瘤臨床分期、組織分級、肌層浸潤、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)(P均<0.05)，與年齡及病理類型無關(guān)(P均>0.05)，詳見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-373的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是婦科最常見三大惡性腫瘤之一，在我國子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率位居?jì)D科惡性腫瘤第2位，僅次于宮頸癌，近年來子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢[6]。雖然治療子宮內(nèi)膜癌的技術(shù)與方法在不斷發(fā)展，但對于晚期和復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌患者的治療效果仍欠佳。因此，進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜癌中具有特異性和敏感性的分子標(biāo)志物是對子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行早期診斷、改善治療效果的關(guān)鍵。

miRNA作為一類保守的非編碼RNA，在各種疾病的病理生理過程扮演基因管理角色，主要通過轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)眾多目標(biāo)基因的表達(dá)[7, 8]。miRNA的表達(dá)失常在腫瘤中是一種常見現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在表觀遺傳修飾、基因變異、生物起源改變及轉(zhuǎn)錄阻抑這四個(gè)主要機(jī)制的失調(diào)。表達(dá)失調(diào)的miRNA不僅影響腫瘤的發(fā)生進(jìn)展，且關(guān)聯(lián)著腫瘤對其抗癌藥物耐藥性的產(chǎn)生[9]。miR-373作為miR-371-372-373家族的一員，主要位于染色體19q13.42上，在不同的腫瘤中，其表達(dá)情況不同，如miR-373在食管鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌中表達(dá)均顯著上調(diào)，促進(jìn)其癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮促癌基因作用[10,11]。miR-373在乳腺癌中可通過TXNIP-HIF1α-TWIST信號軸而促進(jìn)上皮間質(zhì)細(xì)胞的過渡與轉(zhuǎn)移[12]。miR-373在卵巢癌中通過作用于Rab22a抑制卵巢癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，在膀胱癌中通過增強(qiáng)鈣黏蛋白的表達(dá)而顯著抑制癌細(xì)胞的增殖與發(fā)展，發(fā)揮抑癌基因作用[13,14]。Hua等[15]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血清中miR-373 低表達(dá)與臨床預(yù)后不良顯著相關(guān)，且miR-373的表達(dá)水平與腫瘤分級、分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們[16]的前期研究，通過構(gòu)建miR-373-3p慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-373-3p明顯抑制HEC-1A細(xì)胞的增殖和遷移能力，故miR-373具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移的作用。

本研究結(jié)果顯示，miR-373在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，與我們[16]的前期研究結(jié)果一致，表明miR-373在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮癌基因作用。另外本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-373的表達(dá)隨子宮內(nèi)膜癌惡性程度的增高及臨床分期的增加而呈上升趨勢，miR-373的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無淋巴及轉(zhuǎn)移者，相較于肌層浸潤<1/2者，在肌層浸潤≥1/2者中的miR-373的表達(dá)量明顯增加，提示miR-373可能與子宮內(nèi)膜癌的浸潤與轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-373呈高表達(dá)，其表達(dá)量與子宮內(nèi)膜癌惡性程度有關(guān)，可能成為子宮內(nèi)膜癌惡性程度及轉(zhuǎn)移潛能的重要預(yù)測指標(biāo)，并有可能成為子宮內(nèi)膜癌的潛在治療靶點(diǎn)。但miR-373在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用機(jī)制、作用信號通路及靶基因還需要更全面、更深入探討。本實(shí)驗(yàn)所取樣本例數(shù)較少，所取樣本時(shí)間較短，有關(guān)miR-373的表達(dá)情況對子宮內(nèi)膜癌患者的生存及預(yù)后的影響不能做出完整闡述。后續(xù)研究還需擴(kuò)大樣本量后進(jìn)行追蹤隨訪。