大鼠牙胚來源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞中p75NTR時(shí)鐘節(jié)律性表達(dá)*

楊 琨，李 駿，豐奇昊，沈夢(mèng)杰，陳謙謙，羅雅馨，劉 琪△，溫秀杰（.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，貴州遵義 563000；.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，貴州遵義 563000；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院口腔科，重慶 40004）

顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞（EMSCs），是除牙釉質(zhì)以外所有牙齒組織的生成細(xì)胞，被認(rèn)為是牙源性干細(xì)胞的始祖細(xì)胞。在胚胎發(fā)育過程中由顱神經(jīng)嵴遷移至上、下頜突，與牙源性上皮相互作用形成牙囊和牙乳頭，進(jìn)而分化為多種牙齒組織生成細(xì)胞，形成牙本質(zhì)、牙髓、牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨[1]。牙源性的EMSCs在牙齒發(fā)生、發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，并具有向多種牙齒組織細(xì)胞分化潛能的特點(diǎn)。2004年，國(guó)內(nèi)學(xué)者分離并成功培養(yǎng)出第一腮弓來源及頜突來源的顱神經(jīng)嵴源性EMSCs[2?3]，使研究者對(duì)牙胚發(fā)育時(shí)期的始祖細(xì)胞研究有了長(zhǎng)足的發(fā)展。針對(duì)EMSCs的研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)過程中，EMSCs能夠自然向成骨細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分化，細(xì)胞的成分比較復(fù)雜，不太適合作為單純來源的組織細(xì)胞進(jìn)行研究[4]。

但是，以往的研究已經(jīng)認(rèn)為p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體（p75NTR）是神經(jīng)嵴源性干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物[5]。因此，前期研究對(duì)牙胚來源的EMSCs用p75NTR抗體進(jìn)行流式分選與純化，獲得了細(xì)胞形態(tài)較為均一，代表高純度神經(jīng)嵴源性的p75NTR陽性EMSCs（p75+EMSCs），為研究牙齒發(fā)生、發(fā)育機(jī)制提供了一個(gè)良好的體外細(xì)胞模型[6]。進(jìn)一步研究顯示，p75+EMSCs體外未發(fā)現(xiàn)明顯的自然分化跡象，且其增殖能力強(qiáng)、穩(wěn)定，顯示了其較適合作為種子細(xì)胞應(yīng)用于牙組織工程[7?8]優(yōu)勢(shì)。并且有前期研究還證明，p75NTR與Mage?D1的結(jié)合能夠影響EMSCs的礦化能力[9]，這就進(jìn)一步引發(fā)了作者的思考：牙齒發(fā)育過程中形成的周期性礦化間隙紋路—牙體硬組織生長(zhǎng)線的形成機(jī)制是否受到p75NTR的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 一般材料 DMEM?F12培養(yǎng)基、胰酶（Gibco，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），鼠抗人 CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166，p75NTR 單克隆抗體（Abcam，美國(guó)），細(xì)胞RNA提取試劑盒、RT?PCRmix試劑盒（Takara，日本），體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLYMPUS，日本），流式細(xì)胞分析儀（Beckmen Coulter，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real Time?PCR）儀器（Applied Biosystems，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胚胎發(fā)育18.5 d牙胚來源EMSCs培養(yǎng)和分離及表面分子鑒定 SD大鼠孕18.5 d牙胚來源EMSCs（胚胎發(fā)育18.5 d EMSCs）：在大鼠孕18.5 d午間以40 mg∕kg腹腔注射2％戊巴比妥鈉，取出數(shù)個(gè)胚胎，置入6 cm培養(yǎng)皿，剝離羊膜后頭身分離，后分離上下頜，于體式顯微鏡下固定點(diǎn)位，剝開軟骨組織，眼科鑷取出牙胚組織，置入裝有5 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的15 mL離心管，搖晃清洗后離心，加入1 mL 1％Ⅰ型膠原酶置入孵箱內(nèi)消化30 min，中和離心（1 000 r∕min）3 min，去上清液后將組織均勻平鋪于6 cm培養(yǎng)皿中，加入含100 mL∕L胎牛血清的DMEM?F12培養(yǎng)液4～5 mL，置于含5％CO2的恒溫箱中靜置貼壁培養(yǎng)，37℃，約24 h后顯微鏡下可見細(xì)胞從組織塊中爬出并貼壁生長(zhǎng)。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代胚胎發(fā)育18.5 d EMSCs，常規(guī)消化離心后，稀釋并計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)量為每1.5毫升EP管5×105個(gè)，加入已配制好的含3％胎牛血清（FBS）?PBS 重懸細(xì)胞，加入 CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166 及 p75NTR 單克隆抗體 2 μL，4℃冰箱避光孵育 12 h（過夜），12 000 r∕min離心 5 min，加入單抗相對(duì)應(yīng)的熒光二抗避光孵育2 h，無須熒光,加入等量PBS。加入含3％FBS的PBS混合均勻溶液，吹勻，3％FBS?PBS 清洗，12 000 r∕min 離心 5 min，清洗 2～3 次后加 300 μL 3％FBS?PBS，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞表面分子。實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)大于3次。

1.2.2 大鼠胚胎發(fā)育18.5 d牙胚來源EMSCs流式分選 取P1代EMSCs生長(zhǎng)至匯集率90％，按照抗體使用說明書，用自帶熒光p75NTR抗體標(biāo)記消化均勻的EMSCs，4℃孵育半小時(shí)后，流式細(xì)胞技術(shù)分選，收集p75NTR陽性細(xì)胞，進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 p75NTR陽性EMSCs血清休克實(shí)驗(yàn) 取分選后培養(yǎng)至第3代的p75NTR陽性EMSCs，按照以往文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行血清休克實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)節(jié)律性，簡(jiǎn)要說明：50％馬血清加入細(xì)胞中2 h進(jìn)行血清高濃度刺激后棄除，用無血清單純的DMEM∕F12進(jìn)行培養(yǎng)至指定時(shí)間點(diǎn) 0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)行細(xì)胞收集。實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)大于3次。

1.2.4 RealTime?PCR 檢測(cè) p75NTR、NGF、clock、per1、per2、Bmal1在24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量 p75NTR陽性細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間（0、4、8、12、16、20、24 h）點(diǎn)后進(jìn)行細(xì)胞收集，按TRIzol說明書方法提取EMSCs總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。參照GenBank數(shù)據(jù)庫，以Primer primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物；以甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，采用 RealTime?PCR 檢測(cè)，反應(yīng)體系為：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各 0.5 μL、樣本模板 2.0 μL；反應(yīng)條件參照產(chǎn)品說明。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列見表1。

表1 各引物基因序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較用ONE?WAY ANOVA方法，用Bonferroni校正法進(jìn)行多組間均數(shù)比較的校正，檢驗(yàn)水平α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎發(fā)育18.5dEMSCs原代培養(yǎng)與分選后培養(yǎng) 通過組織塊法及膠原酶消化法成功獲得并培養(yǎng)了胚胎發(fā)育18.5 d胚胎時(shí)期牙胚來源EMSCs，與分選后第3代的p75NTR陽性EMSCs比較，利用p75NTR抗體分選后的細(xì)胞形態(tài)更為規(guī)則均一，為間充質(zhì)干細(xì)胞紡錘樣形態(tài)，呈梭形或多邊形。見圖1。

圖1 胚胎發(fā)育18.5 d EMSCs原代及分選后培養(yǎng)

2.2 胚胎發(fā)育18.5 d EMSCs流式表面分子鑒定 通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)胚胎發(fā)育18.5 d EMSCs表面分子，細(xì)胞陽性表達(dá)的結(jié)果分別為CD14（93.58％）、CD29（95.16％）、CD44（98.66％）、CD90（92.72％）、CD105（28.50％）、CD146（95.21％）、CD166（97.23％）和 p75NTR（90.18％），陰性表達(dá) CD45（0.43％）。

2.3 RealTime?PCR 檢測(cè) p75NTR、NGF、clock、per1、per2、Bmal1在血清休克實(shí)驗(yàn)后24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量 p75NTR與NGF的表達(dá)在血清休克后出現(xiàn)與per1、per2節(jié)律性基因表達(dá)趨勢(shì)相一致性的節(jié)律性震蕩，從0 h開始至16 h時(shí)間點(diǎn)呈下降趨勢(shì)，而表達(dá)最低點(diǎn)在16 h左右，之后逐漸呈表達(dá)升高趨勢(shì)；clock基因表達(dá)未出現(xiàn)周期性的節(jié)律震蕩，而Bmal1節(jié)律性表達(dá)出現(xiàn)提前性，表達(dá)最低點(diǎn)在12 h時(shí)間點(diǎn)，要比其他基因表達(dá)時(shí)間提前4 h左右。見圖2。

圖2 RealTime?PCR檢測(cè)各指標(biāo)在24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量

3 討 論

為研究p75NTR與EMSCs在牙發(fā)育中存在的重要作用，作者選擇SD大鼠胚胎頜突組織作為培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)主要對(duì)象EMSCs的來源。胚胎第12.5天的EMSCs是選擇作為牙發(fā)育啟動(dòng)期代表的EMSCs。前期研究中，課題組選擇牙發(fā)育啟動(dòng)期EMSCs作為實(shí)驗(yàn)研究主要對(duì)象，對(duì)此EMSCs群進(jìn)行純化，即采用p75NTR[9]被認(rèn)為是神經(jīng)嵴源性EMSCs的特異性標(biāo)志物[3]。對(duì)EMSCs進(jìn)行流式分選，所獲得細(xì)胞形態(tài)均一，能代表高純度神經(jīng)嵴源性 p75NTR 陽性的頜突 EMSCs（p75+EMSCs）[6]。進(jìn)而對(duì)p75+EMSCs進(jìn)行體外增殖及分化潛能的觀察，發(fā)現(xiàn)其在體外擴(kuò)增十代后p75+EMSCs增殖活性和細(xì)胞表型穩(wěn)定。并未發(fā)現(xiàn)明顯的自然分化現(xiàn)象，保持了良好的多項(xiàng)分化潛能。而要討論整個(gè)頜面部及牙發(fā)育初期及礦化節(jié)律線形成時(shí)期EMSCs存在的重要作用，只利用牙發(fā)育啟動(dòng)期（胚胎發(fā)育12.5 d）的EMSCs來進(jìn)行討論存在一定缺陷性。所以本研究以牙齒周期節(jié)律性礦化線形成作為主要研究目的，選擇牙發(fā)育鐘狀期（胚胎發(fā)育18.5 d）EMSCs，即來源于牙胚的頜突 EMSCs（即牙發(fā)育礦化前期）作為牙發(fā)育后期的代表，討論研究相關(guān)內(nèi)容。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過分選的胚胎發(fā)育18.5 d EMSCs的形態(tài)呈更為均一、純度較高的梭邊形或多邊形，或間充質(zhì)干細(xì)胞紡錘樣形態(tài)，流式細(xì)胞儀神經(jīng)嵴來源的EMSCs表面分子的鑒定，更確定了本研究主體細(xì)胞的身份。

p75NTR作為腫瘤壞死因子超家族（TNFR）的成員，廣泛表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)及外周系統(tǒng)里[14]。p75NTR參與了多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的傳導(dǎo)并且調(diào)控多種生物學(xué)功能包括感覺神經(jīng)元的發(fā)生，肝組織及肌肉的再生，細(xì)胞外基質(zhì)的重建，糖代謝及礦化能力的調(diào)控。而大多數(shù)能夠調(diào)節(jié)代謝功能的基因都能夠被時(shí)鐘節(jié)律性所調(diào)控，而代謝的異常也與時(shí)鐘節(jié)律調(diào)控的紊亂存在相關(guān)性[15?17]。近年來，有研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周系統(tǒng)中，p75NTR的節(jié)律性震蕩表達(dá)受到clock∕Bmal1復(fù)合體基因的調(diào)控，主要是clock∕Bmal1直接結(jié)合到p75NTR基因啟動(dòng)子中非經(jīng)典的E?BOX元件上對(duì)其節(jié)律性表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，而這二者復(fù)合體也大量地表達(dá)在除了視神經(jīng)上核之外的外周組織中[15，18]，證明在外周組織中不同細(xì)胞中p75NTR受到的節(jié)律性調(diào)控也是由clock∕Bmal1主導(dǎo)。血清休克實(shí)驗(yàn)廣泛運(yùn)用在造成時(shí)鐘基因節(jié)律性震蕩表達(dá)[19]，本研究中也利用血清休克實(shí)驗(yàn)體外模擬時(shí)鐘環(huán)境，證實(shí)了p75NTR在牙胚來源的EMSCs中也存在節(jié)律性表達(dá)，并且震蕩模式與其配體NGF及時(shí)鐘節(jié)律相關(guān)基因per1[20]、per2[21]相一致，表明在外周組織包括牙發(fā)育相關(guān)組織中，p75NTR及其相關(guān)配體也存在時(shí)鐘節(jié)律性表達(dá)。NGF作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子，不僅僅是對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化生長(zhǎng)存在促進(jìn)關(guān)系，而對(duì)細(xì)胞礦化分化也存在一定的影響，當(dāng)NGF的表達(dá)量在牙槽骨愈合時(shí)候能不斷升高[22]，并且NGF能夠促進(jìn)下牙槽神經(jīng)及牙槽骨的愈合[23]。而本研究結(jié)果顯示，NGF也參與到時(shí)鐘節(jié)律性表達(dá)中，從一方面也支持了作者的猜想：p75NTR及其配體NGF參與到牙組織發(fā)育礦化節(jié)律線的形成中；本課題組前期研究也表明，p75NTR與NGF通過結(jié)合Mage?D1能夠調(diào)控EMSCs的礦化能力[13]。

牙體硬組織的生長(zhǎng)線反映了基質(zhì)及相關(guān)蛋白生成，分泌在礦化過程中的節(jié)律性變化，并且受到多方面因素的調(diào)控。下丘腦視交叉上核是節(jié)律性的神經(jīng)中樞，在人類的各種生理活動(dòng)的節(jié)律中發(fā)揮決定性作用。在外周振蕩器接受下丘腦的節(jié)律性信號(hào)，做出反應(yīng)，調(diào)整相關(guān)基因表達(dá)形成節(jié)律。釉質(zhì)的橫紋及內(nèi)線與釉柱垂直，均代表了釉質(zhì)形成的晝夜節(jié)律性，內(nèi)線是釉柱橫紋間的 2～3 條線，而釉柱橫紋在人類中為 5.3 μm[10，24]。而人的牙齒牙本質(zhì)生長(zhǎng)線平均間隔為4～8 μm，周期也為1 d[10?11]。而不僅僅是牙體硬組織的鈣化，包括牙齒的萌出也存在晝夜節(jié)律性的變化[25?26]，因此本研究及結(jié)合課題組前期研究[13]均支撐了p75NTR及其配體可能參與到牙體硬組織形成的節(jié)律性表象中，然而研究在繼續(xù)深入的過程中仍然可以對(duì)礦化相關(guān)基因、細(xì)胞外基質(zhì)形成，以及外泌體等對(duì)礦化線存在影響的因素進(jìn)行監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步完善牙發(fā)育及組織工程應(yīng)用的基本理論。